本实验方案描述了一种利用核酸外切酶III（ExoIII）和S1核酸酶在质粒DNA中生成单向嵌套缺失的标准方法。该方法适用于需要构建一系列缺失突变体以进行功能分析或测序的研究。
原理：核酸外切酶III能够从双链DNA的3'端逐步切除核苷酸，但仅对平末端或5'突出末端有效，而对3'突出末端具有抗性。通过选择合适的限制性内切酶，使质粒的一端为ExoIII敏感（平末端或5'突出），另一端为ExoIII抗性（3'突出），从而控制缺失方向。随后用S1核酸酶切除单链区域，经Klenow片段补平、连接后转化大肠杆菌，即可获得一系列长度递减的缺失克隆。
步骤：
- 用两种限制性内切酶消化质粒DNA，使一端为ExoIII敏感（平末端或5'突出），另一端为ExoIII抗性（3'突出）。确保敏感端的方向与所需缺失方向一致。
- 85°C加热30分钟灭活限制性内切酶。
- 酚/氯仿抽提、氯仿抽提、乙醇沉淀纯化消化后的DNA。
- 将DNA重溶于20 μL 1× One Phor All缓冲液中。
- 加入20 μL 2× ExoIII缓冲液，在目标温度下预孵育至少2分钟。
- 准备31个无菌Eppendorf管，每管加入3 μL S1核酸酶/S1核酸酶缓冲液（20 μL 5× S1核酸酶缓冲液、79 μL H2O、1 μL S1核酸酶[50 U/μL]），标记时间t=0至30分钟，置于冰上。
- 从预孵育的缺失混合物中取出2 μL加入t=0管，置于冰上。将剩余缺失混合物放回水浴，加入1 μL ExoIII（~100 U），轻轻吹打混匀，继续水浴。
- 在指定时间点，从缺失混合物中取出2 μL加入对应的S1管，冰上孵育。
- 所有时间点取样完成后，将所有S1管同时室温孵育30分钟。
- 每管加入1 μL S1终止缓冲液，65°C孵育10分钟。
分析：取一半反应产物在中性琼脂糖凝胶上电泳，比较条带大小与原始样品（t=0）及分子量标记。若缺失速率过快，可在ExoIII缓冲液中加入0-150 mM NaCl以减慢速率；改变反应温度也可调节缺失速率。
后续处理：剩余一半反应产物可用Klenow片段补平、连接，转化大肠杆菌。
缓冲液配方：
- S1核酸酶储存缓冲液：10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM Zn(OAc)₂, 50% (v/v) 甘油。
- 6× ExoIII核酸酶缓冲液：360 mM Tris-Cl (pH 8.0), 4 mM MgCl₂, 6 mM DTT。
- 5× S1核酸酶缓冲液：150 mM 乙酸钠 (pH 4.6), 250 mM NaCl, 5 mM ZnCl₂, 5% (v/v) 甘油。
- S1终止缓冲液：500 mM Tris-Cl (pH 8.0), 125 mM EDTA (pH 8.0)。