本方案采用醋酸锂/PEG处理法，将DNA（质粒DNA或线性DNA）转化至酵母细胞中。该方法适用于酵母遗传操作，如基因敲除、过表达等。

步骤

1. 从过夜培养的酵母培养物中取适量细胞，接种至300 ml液体YPD培养基中。

2. 培养至细胞密度达到5×10⁶至1×10⁷个/ml（参见提示1）。

3. 室温下，用GSA转子以5000 rpm（4000×g）离心5分钟。

4. 弃上清，用10 ml无菌ddH₂O重悬细胞沉淀，转移至40 ml离心管中。

5. 室温下，用SS34转子以7000 rpm（5900×g）离心5分钟。

6. 弃上清，用1.5 ml无菌1×TEL溶液重悬细胞。

7. 在Branson 2200超声波水浴中超声处理细胞3分钟（参见提示2）。

8. 30℃恒温振荡孵育1小时（参见提示3）。

9. 向微量离心管中加入100 μg鲑鱼精DNA作为载体，以及最多5 μg转化DNA（总体积不超过20 μl）（参见提示4）。设置仅含载体DNA的阴性对照管。

10. 向每管中加入200 μl步骤5中的酵母悬液。

11. 30℃振荡孵育30分钟（参见提示3）。

12. 向每管中加入1.2 ml无菌TEL/40% PEG 4000溶液。

13. 30℃振荡孵育30分钟（参见提示3）。

14. 42℃热激10分钟（参见提示5）。

15. 微量离心机最高速离心5秒。

16. 用0.5 ml无菌1×TE缓冲液洗涤细胞1-2次：充分重悬后最高速离心5秒，弃上清。

17. 用1 ml无菌1×TE缓冲液重悬最终细胞沉淀，取200 μl涂布于含必需氨基酸的SD选择平板上。

18. 30℃（或允许温度）培养直至转化子出现。

试剂配方

40%葡萄糖：40%（w/v）D-葡萄糖，高压灭菌。

YPD培养基：用ddH₂O定容至950 ml，冷却至65℃后加入50 ml无菌40%葡萄糖；含20 g蛋白胨、10 g酵母提取物；高压灭菌30-45分钟。

SD平板：冷却至65℃后加入50 ml无菌40%葡萄糖；1 L ddH₂O中含6.7 g酵母氮源（无氨基酸，Difco）、20 g琼脂（Difco）；高压灭菌30-45分钟后倒平板。

50% PEG 4000：50%（w/v）聚乙二醇（MW约3350-4000），过滤除菌。

TEL/40% PEG 4000溶液（20 ml）：16 ml 50% PEG 4000、2 ml 10×TE缓冲液、2 ml 1 M醋酸锂。

质粒DNA或PCR产物。

鲑鱼精DNA：参见“酵母转化用鲑鱼精DNA制备方案”。

TEL溶液：用无菌ddH₂O稀释1×TE缓冲液至含0.1 M醋酸锂。

1 M醋酸锂：用稀乙酸调pH至7.5，高压或过滤除菌。

TE缓冲液（10×）：0.1 M Tris-HCl、0.01 M EDTA，pH 7.5，高压或过滤除菌。

提示

1. 将细胞稀释至2×10⁶个/ml于新鲜YPD中再培养2代，转化效率可提高2-3倍。

2. 超声步骤仅对最高转化效率重要。

3. 对于温度敏感菌株，在允许温度下孵育。

4. 鲑鱼精载体DNA的质量是高效转化的最关键因素。

5. 42℃孵育对大多数温度敏感突变体适用。