描述

高效醋酸锂转化法是一种用于酵母（如酿酒酵母）的经典遗传转化方法，通过醋酸锂处理细胞壁，结合聚乙二醇（PEG）和热激处理，使外源DNA进入细胞。该方法操作简便、成本低廉，适用于大多数酵母菌株的转化。

步骤

1. 接种2-5 mL液体YPED培养基或10 mL合成培养基，30°C振荡培养过夜。
2. 计数过夜培养物，接种50 mL预热YPED培养基至细胞密度为5×10^6个/mL。
注意：
i) 将过夜培养物用水稀释10倍或更多。
ii) 小心地将10 μL细胞悬液置于盖玻片与血球计数板之间，静置几分钟。计数板网格面积为1平方毫米，分为25个大方格，体积为10^-4 mL。
iii) 计数5个对角线方格中的细胞数。
iv) 计算细胞滴度：计数细胞数×5×稀释倍数×1/（25个方格体积）。例如：239个细胞×5×10（稀释倍数）×1/10^-4 mL = 1.2×10^8个/mL。
v) 酿酒酵母通过出芽繁殖，芽细胞计为一个细胞；若芽体大小相等且可见额外芽体，则计为两个细胞。
vi) 也可使用OD660测定细胞滴度，但细胞数与OD的关系因菌株而异。
3. 30°C、200 rpm振荡培养至细胞密度相当于2×10^7个/mL，约需3-5小时。此培养物足够进行10次转化。
注意：
i) 确保细胞完成至少两次分裂。
ii) 转化效率在3-4次细胞分裂内保持稳定。
4. 将培养物转移至无菌50 mL离心管，1000×g离心5分钟。
5. 弃上清，用25 mL无菌水重悬细胞，再次离心。
6. 弃水，用1.0 mL 100 mM醋酸锂重悬细胞，转移至1.5 mL微量离心管。
7. 最高速离心15秒，用微量移液器吸除醋酸锂。
8. 重悬细胞至终体积500 μL（2×10^9个/mL）——约加入400 μL 100 mM醋酸锂。
注意：若培养物细胞滴度高于2×10^7个/mL，应增加醋酸锂体积以维持悬液滴度为2×10^9个/mL；若低于此值，则减少醋酸锂。
9. 将鲑鱼精DNA（SS-DNA）煮沸5分钟，迅速置于冰水浴中冷却。
**** 不必每次煮沸载体DNA，可保存小份于冰箱，每3-4次冻融后煮沸一次。取出后置于冰上。****
10. 涡旋细胞悬液，取50 μL分装至离心管，离心后吸除醋酸锂。
11. 基本“转化混合物”组成：
240 μL PEG（50% w/v）
36 μL 1.0 M醋酸锂
50 μL SS-DNA（2.0 mg/mL）
X μL DNA
34-X μL无菌ddH2O
总计360 μL
按顺序小心加入上述成分。
注意：顺序很重要！PEG应先加入，以保护细胞免受高浓度醋酸锂的损害。也可将除DNA外的成分预混，取355 μL TRAFO混合物覆盖细胞沉淀，再加入5 μL DNA并混匀。注意准确移取粘稠的TRAFO混合物。
12. 剧烈涡旋每管约1分钟，直至细胞沉淀完全混匀。
13. 42°C水浴热激40分钟。
注意：最佳时间因酵母菌株而异，若需高效转化，请测试优化。
14. 6000-8000 rpm离心15秒，用微量移液器吸除转化混合物。
15. 每管加入600 μL无菌水，轻轻吹吸重悬沉淀。
注意：若需高效转化，此步骤应尽量轻柔。
16. 涂板！
注意：涂布酵母菌液时，用无菌玻璃棒轻轻均匀涂布，尽量减少划动次数。待液体被平板吸收后再培养。
17. 平板培养2-4天，待转化子长出。

配方

10×醋酸锂：1 M醋酸锂，过滤除菌。
50% PEG 3350：过滤除菌。

耗材

无特殊要求。

提示

无。