3.2    脱水蛋白具有保护生物膜的作用  



可溶性物质，如甘氨酰、甜菜碱、脯氨酸和蔗糖等能够保护蛋白质等生物大分子的结构，而脱水蛋白在防止蛋白质变性作用方面可能更强，因为脱水蛋白既可以通过丰富的亲水残基与水结合成水合分子，与普通溶质一样通过排斥作用促使变性蛋白质复性，同时又可以通过疏水  K  片段形成的兼亲性α螺旋与部分变性的蛋白质及膜结合，形成新的物理界面，加强蛋白质特定结构域与小分子溶质的排斥作用，防止蛋白质及膜的进一步变性。  



生物膜空间结构的维持与结构水分子有关，脱水过程可能破坏水膜的完整性，缩短膜脂双层间的距离，使各成分相瓦混合，最终导致生物膜结构的不可逆改变。脱水蛋白与水膜损坏的生物膜大分子相互作用可以增强对膜结构的保护作用。小麦脱水蛋白  WCOR410  在脱水条件下聚集在细胞膜附近，氨基酸序列分析显示该蛋白中含有大量酸性及富含羟基的氨基酸，这就使其具有与膜上磷脂和类固醇相互作用的能力。脱水过程中，膜水分的丧失会改变膜的相变温度，造成不可逆损伤，而  WCOR410  的兼亲α螺旋区域将替代水分的位置，其分子内羟基与磷脂分子中的极性键形成氢键，使膜脂的状态仍类似于未脱水状态，这种情况类似于寡糖类物质在冷驯化中的作用。WCOR410  中的酸性、碱性、中性基团分别和膜脂中不同种类的膜脂分子靠次级键结合，防止脂类分子问的相互作用，从而阻止膜融合或双层膜脂向非双层膜相中的六角形Ⅱ(Hexagonal  Ⅱ)相转变。另外，在盐胁迫条件下，该蛋白质中的带电基团(占43％)由相互作用转为与离子结合，形成盐桥，阻止盐类结晶，从而保护细胞膜。但是  WCOR410  脱水蛋白位于质膜的外表面和细胞间隙，伴随这种情况而出现了一个问题：WCOR410  是怎样运输的？目前还没有合理的解释。  



脱水蛋白不仅可以与原生质膜相互作用，还可以与细胞内膜相互作用。脱水蛋白在膜附近定位显示它们可以稳定细胞膜结构，在逆境条件下尤其重要。免疫分析显示位于胞液的玉米脱水蛋白  DHN1  在环境胁迫下大量聚集在细胞内膜附近。在冰冻胁迫下，小麦酸性脱水蛋白  COR15  也在质膜附近大量积累。玉米  DHN1  含有两个  K  片段，可形成类似  α-synueleins  的脂结合  A2  型α螺旋结构，推测该蛋白可以通过  K  片段形成的α螺旋结构与膜中的脂质小囊泡  (SUV)  结合。CD  分析显示在10mmol/L  SDS  存在时其二级结构中有9％的α螺旋出现，当  DHN1  与  SUV  结合时，其螺旋程度会增高。脱水蛋白与  SUV  的结合可以减少单层膜的负面弯曲损伤而防止膜相互混合或溶解。另外，  DHN1  易结合于富含磷脂酸  (PA)  的囊泡上，PA  在植物细胞膜中含量很少(只占磷脂总量的1％2％)，但是当有干旱等胁迫信号时，PA  的含量会随着磷脂酶活性的增强而升高，丰富的  PA  可以增强细胞膜的负面极性程度，影响蛋白与膜的静电反应，因此  PA  作为各种环境胁迫如渗透胁迫等的第二信使。在环境胁迫下  DHN1  通过与富含  PA  的膜囊泡结合，防止膜形成六角形Ⅱ相，维持膜结构的稳定。由此推测玉米脱水蛋白  DHN1  通过两种途径稳定细胞膜：一是通过结合于细胞膜小囊泡，改变膜界面的极性密度，从而减少膜的混合和溶解；二是通过结合于富含  PA  的囊泡，减少膜的负面弯曲损伤，阻止膜向六角形Ⅱ相的转变。  



3.3    脱水蛋白具有防冻剂活性作用  



植物的耐寒性与体内淀粉的积累有关，单糖和多糖是淀粉降解的主要成分，能够防止由于脱水而对植物细胞造成的伤害。在寒冷胁迫下，淀粉含量因降解将逐渐减少，因此维持α淀粉酶的活性对于淀粉的降解非常重要，而α淀粉酶对淀粉水解时，要求在其附近有足够的水分。West  blots  分析显示在寒冷胁迫下白桦树(Betula  pubescens  ehrh)幼苗中常伴随一种24  ku  脱水蛋白的积累，酶分析显示该蛋白在寒冷失水时能够将局部足够的水分集中在α淀粉酶附近，从而增强α淀粉酶的催化活性，维持淀粉的适度水解，说明脱水蛋白具有一定的水分保持能力。桃树脱水蛋白  PCA60  在低温下也具有保水能力，其防冻活性类似于北极鱼类中的防冻蛋白。PCA60  富含亲水性氨基酸(Gly，Glu，Asp  和  Thr)，具有和水分子结合的能力，因此能够结合在冰晶表面阻止水分子聚合形成冰晶格，从而防止冰晶格的生长。  



脱水蛋白的防冻剂作用还表现在冻融过程中对乳酸脱氢酶  (LDH)  活性的保护方面。拟南芥脱水蛋白  COR15a  受寒冷诱导，能提高拟南芥的原生质体和叶绿体的耐寒能力，在所有已知的寒冷诱导型脱水蛋白中，COR15a  对乳酸脱氢酶活性的保护能力最强(0.1  mg/mL  的  COR15a  能够保持50％  LDH  活性)，大麦脱水蛋白  Dhn5  和  P-80  在植物的耐寒方面有许多相似之处，Western  blot  显示  P-80  主要受寒冷诱导，Dhn5  受寒冷胁迫的高度调节，干旱和  ABA  也可诱导其产生，两者在冻融过程中对  LDH  的保护能力相似，PD50(Protective  Dosage  50％)值均在50  nm  左右，其对  LDH  活性保护能力仅次于  COR15a(PD50  为6.6  nm)，两种蛋白均可维持100％的乳酸脱氢酶活性。脱水蛋白  K  片段形成的α螺旋结构可能与变性的  LDH  疏水基团作用，防止  LDH  进一步变性，因此推测  LDH  活性的维持可能与脱水蛋白  K  片段的数量有关。Kn  型脱水蛋白大多具有防冻活性，但是含有3个  K  片段的  COR15a  的  PD50  值却比含有9个  K  片段的  P-80，Dhn5  和  PCA60  高，而且  K  片段数量低于3的脱水蛋白防冷冻活性较低(大豆  Mat1)，因此  K  片段的数量不能低于3个。尽管  K  片段的多少并不是防冻活性强弱的判断标准，但是  K  片段的存在可能是脱水蛋白具有防冻活性的一个原因。大豆27  ku  脱水蛋白对  LDH  的防冻活性高于26  ku，因此推测脱水蛋白分子量的不同，尤其是  Y  片段氨基酸含量的高低是影响其防冻活性的一个因素。  



3.4    脱水蛋白具有结合金属离子的作用  



干旱、冷冻和盐害等环境胁迫均能导致植物脱水，造成细胞中离子浓度增加。脱水蛋白能与金属离子结合，减少细胞脱水过程中盐分沉淀和结晶的可能性，降低离子毒性。拟南芥脱水蛋白  RAB18，LTI29，LTI30  和  COR47  都可与  Cu2+  和  Ni2+  相互作用，LTI30  还可结合  Co2+  和  Zn2+。最近从蓖麻  (Ricinus  communis  L)  幼苗中分离出一种  KS  型脱水蛋白  ITP，在韧皮部中具有长距离运输离子的作用。纯化的  ITP  在体外可结合  Fe3+，也可以结合  Zn2+，Cu2+  和  Mn2+，但在体内只能与  Fe3+  结合。脱水蛋白缺少结合金属离子的特殊序列，为何具有结合金属离子的能力？研究表明拟南芥脱水蛋白的金属离子结合能力有赖于其结构中大量存在的丝氨酸片段，小麦  WCOR410  有超过43％的参与金属离子结合反应的氨基酸片段。芹菜(Apium  graveolens)脱水蛋白  VcaB45  位于液泡膜上，磷酸化后  Ca2+  的结合能力可以提高100倍，ERD14  和  ERD10  可以在液泡膜附近累积，推测脱水蛋白是作为  Ca2+  缓冲液或  Ca2+  依赖型伴侣分子起作用。拟南芥脱水蛋白ERD14，ERD10  和  COR47  均为酸性蛋白，在无胁迫时经  CKⅡ  磷酸化后具有  Ca2+  结合活性，其中  ERD14  的  Ca2+  结合能力最高；在寒冷胁迫时，同样表现出依赖于磷酸化的  Ca2+  结合活性。拟南芥  RAB18  和  XERO2  两种脱水蛋白分别为中性和碱性蛋白，RAB18  经  CKⅡ  磷酸化后具有微量  Ca2+  结合活性，而  XERO2  则不能结合  Ca2+。ERD14，ERD10  和  COR47  等3种酸性脱水蛋白均为  SKn  型，具有富含  Ser  的  S  片段和  K  片段，缺少  Y  片段；而  RAB18  为  Y2SK2  型蛋白，在  N  末端含有两个  Y  片段；XERO2  为  K6  型脱水蛋白，缺少  S  片段，不能被  CKⅡ  磷酸化，缺乏  Ca2+  结合活性。由此推测酸性脱水蛋白的  Ca2+  结合区域位于  S  片段上游，并且金属离子的结合能力依赖于  S  片段的磷酸化位点。  



3.5    脱水蛋白具有抗氧化活性  



环境胁迫可以诱导活性氧自由基的产生，导致脂质过氧化作用增强以及膜泄露，因此，限制活性氧类物质的产生对保护细胞结构至关重要。脱水蛋白  ITP  和  ERD14  具有金属离子结合活性，PvSR3  转录产物在重金属胁迫下大量增加并受到外源  H2O2  调节。推测脱水蛋白与金属的结合是降低氧化损伤的一种防御机制。在寒冷胁迫下，表达  Cicus  CuCOR19  脱水蛋白的转基因烟草与对照植株相比，其电解质泄露和丙二醛产物(MDA)降低，说明  CuCOR19  的过量表达减少了脂质过氧化作用，提高了转基因烟草的抗冻能力。大肠杆菌  (E.coli)  表达系统中纯化的  CuCOR19  在体外可以防止大豆脂质体的过氧化反应，对脂质体的抗氧化作用高于白蛋白、谷胱甘肽、脯氨酸、甘氨酸，甜菜碱和蔗糖等物质，表明脱水蛋白在寒害过程中可以通过清除自由基的作用提高植物的抗寒性。进一步的研究证实了脱水蛋白的自由基清除活性，如CuCOR19  可清除羟基和过氧化物自由基，但不能除去过氧化氢和超氧化物自由基，其清除自由基的活性远高于甘露醇，而与血清蛋白相当。另外，羟基自由基作用的靶位点是  Gly，His  和  Lys  等残基，而脱水蛋白中富含这些氨基酸，表明脱水蛋白可以利用这些极性氨基酸清除自由基，保护生物膜免受伤害。