引言

电泳是一种利用电场驱动带电分子在溶液中迁移的技术。分子的迁移速度受电场强度、分子净电荷、大小和形状，以及介质的离子强度、粘度和温度等因素影响。作为分析工具，电泳操作简便、速度快且灵敏度高，既可用于研究单一带电物质的性质，也可作为分离技术。

通常，样品在支持基质中进行电泳，如纸张、醋酸纤维素、淀粉胶、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。基质抑制了因加热引起的对流混合，并为电泳过程提供记录，电泳结束后可对基质进行染色、扫描、放射自显影或保存。

支持基质的选择及分子分离原理

最常用的支持基质是琼脂糖和聚丙烯酰胺，它们均为多孔凝胶，能根据分子大小实现分离。多孔凝胶通过筛分作用，阻碍大分子迁移而允许小分子自由通过。琼脂糖凝胶较为坚硬且易操作，适合分离较大分子如核酸、大蛋白及蛋白复合物；聚丙烯酰胺凝胶可制备高浓度，适合分离大多数蛋白质和需要较小孔径的寡核苷酸。

蛋白质和核酸的电泳分离

蛋白质为两性分子，其净电荷由介质pH决定。pH高于蛋白等电点时，蛋白带负电，向阳极迁移；低于等电点时带正电，向阴极迁移。蛋白质的净电荷与分子大小无关，不同蛋白单位质量带电量不同，因此在非变性条件下，蛋白质的电泳分离受分子大小和电荷共同影响。核酸在电泳pH范围内始终带负电，且每个核苷酸的磷酸基提供固定负电荷，核酸的电泳分离严格依赖分子大小。

SDS-PAGE蛋白质分离

十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，通过包裹多肽主链使蛋白质变性，SDS与蛋白的结合比例约为1.4:1（质量比），赋予多肽均匀的负电荷密度，使其迁移仅受分子量影响。通常需用2-巯基乙醇或二硫苏糖醇还原蛋白质中的二硫键，使蛋白质呈随机线圈构象，便于按大小分离。

分子量测定

通过与已知分子量的蛋白质或核酸标准品同时进行SDS-PAGE或琼脂糖电泳，测定样品的迁移距离（Rf），并绘制迁移距离与分子量对数的标准曲线，即可推算样品的相对分子量。

缓冲体系

电泳缓冲体系分为连续和不连续两种。连续体系仅含单一分离胶，缓冲液在电泳槽和胶中相同；不连续体系在分离胶上叠加一层大孔径的堆积胶，二者缓冲液不同，电泳槽缓冲液亦不同，不连续体系分辨率显著优于连续体系。

Western Blot转膜及免疫检测流程

Western Blot技术基于电泳分离后的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，固定蛋白质以便后续的免疫学检测。转膜时，将电泳胶与滤纸、泡沫垫及不锈钢网层层夹紧，置于转膜缓冲液中，通过扩散或电泳驱动蛋白质从胶转移至膜上。转膜完成后，膜可用特异性抗体进行探针检测，实现蛋白质的鉴定和定量。

实验注意事项及染色方法

样品制备时需加入SDS-PAGE破坏液（含Tris-HCl、2-巯基乙醇、SDS、甘油及溴酚蓝），并加热变性。电泳后可用考马斯亮蓝或铜氯化物染色以显示蛋白条带。转膜过程中应防止硝酸纤维素膜干燥，确保膜与胶紧密接触，避免气泡产生。免疫检测步骤包括封闭、抗体孵育、洗涤及显色，常用辣根过氧化物酶标记的二抗及相应底物显色。

总结

Western Blot技术结合了电泳分离和免疫检测的优势，是蛋白质分析中不可或缺的工具。其高灵敏度和特异性使其广泛应用于生物医学研究、疾病诊断及药物开发领域。