一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种基于免疫酶技术的新型免疫测定方法。其核心原理是将抗原或抗体吸附于固相载体上（称为包被），随后加入待测抗体或抗原，再加入相应的酶标记抗体或抗原，形成抗原-抗体-酶标记抗体的复合物。通过酶催化底物反应生成有色产物，利用分光光度计测定光吸收值，定量分析待测抗体或抗原的含量，二者含量与颜色深浅成正比。
二．实验原理
（一）酶的交联
免疫酶技术中常用的酶包括过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等。ELISA中最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酯酶。HRP催化氧化还原反应，呈色后需立即测定以避免空气氧化导致颜色变化。HRP与抗体的交联主要有戊二醛法和过碘酸盐氧化法两种。
1. 戊二醛法
戊二醛作为双活性试剂可将酶与抗体交联。其交联机理可能涉及Michael加合物形成或不饱和醛与氨基形成Schiff碱。戊二醛交联有一步法和二步法：一步法中酶、抗体和戊二醛同时反应，产率低且易形成聚合物；二步法先用戊二醛处理酶，再加入抗体，减少聚合，产率稍高但仍有限。标记后需通过凝胶过滤等方法去除未标记抗体以避免干扰。
2. 过碘酸盐氧化法
HRP为糖蛋白，过碘酸盐氧化糖部分羟基生成醛基，再与抗体结合，最后用硼氢化钠还原形成稳定结合物。此法结合效率高，HRP与抗体的摩尔比可达2-3，但酶活性和免疫活性损失较大。
戊二醛质量对交联效果影响显著，需新鲜、避光低温保存。HRP的浓度和纯度常以辅基氯化血红素含量表示，辅基最大吸收峰为403nm，蛋白质最大吸收峰为275nm。HRP纯度（RZ值）越高，杂质越少，ELISA用HRP要求RZ值≥3.0。
（二）酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原在交联剂作用下形成的产物，兼具免疫特异性和酶促反应能力，能实现信号放大。不同酶对应不同底物，常用酶及其底物如下：
| 酶 | 底物 | 显色反应 | 测定波长（nm） |
|---|---|---|---|
| 辣根过氧化物酶（HRP） | 邻苯二胺（OPD）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）、5-氨基水杨酸（5-AS）、邻联苯甲胺（OT）、ABTS | 橘红色、黄色、棕色、蓝色、蓝绿色 | 492*, 460**, 450, 449, 425, 642 |
| 碱性磷酸酯酶 | 4-硝基酚磷酸盐（PNP）、萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 | 黄色、红色 | 400, 500 |
| 葡萄糖氧化酶 | ABTS+HRP+葡萄糖、葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 | 黄色、深蓝色 | 405, 420 |
| β-D-半乳糖苷酶 | 4-甲基伞酮基-半乳糖苷（4MuG）、硝基酚半乳糖苷（ONPG） | 荧光、黄色 | 360, 450, 420 |
*终止剂为2mol/L硫酸
**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同底物终止剂不同
HRP催化反应示意：HRP + H2O2 → 复合物；复合物 + AH2 → 过氧化物酶 + H2O + A；其中AH2为无色底物供氢体，A为有色产物。
（三）ELISA常用四种方法
1. 直接法测定抗原：抗原吸附于载体，加入酶标抗体，形成复合物，加入底物，底物降解量与抗原量成正比。
2. 间接法测定抗体：抗原吸附于载体，加入抗体形成复合物，加入酶标抗体，加入底物，底物降解量与抗体量成正比。
3. 双抗体夹心法测定抗原：固相载体包被第一种动物抗体，加入抗原，加入第二种动物抗体，再加入酶标抗抗体，加入底物，底物降解量与抗原量成正比。
4. 竞争法测定抗原：固相载体包被抗体，加入酶标抗原和待测抗原竞争结合，加入底物，底物降解量与未知抗原量成反比。
三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板，40孔或96孔）。
2. 酶联免疫检测仪。
3. 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。
4. 包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃保存。配方：Na2CO3 0.15g，NaHCO3 0.293g，蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/L pH7.4 PBS-Tween-20，4℃保存。配方：NaCl 8g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，Tween-20 0.5ml，蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液。
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制0.1M柠檬酸缓冲液，邻苯二胺10mg，加入30% H2O2 40μl。
9. 终止液：2mol/L硫酸。
四．操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原稀释至1～10μg/孔，每孔加200μl，37℃孵育1小时后，4℃冰箱保存16～18小时。
2. 洗涤：倒尽孔内液体，加满洗涤液，静置3分钟，重复3次，倒置于吸水纸上使液体流尽。
3. 加封闭液200μl，37℃孵育1小时。
4. 洗涤同步骤2。
5. 加被检血清稀释液稀释后，每孔200μl，37℃孵育2小时，同时设稀释液对照。
6. 洗涤同步骤2。
7. 加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 200μl，37℃孵育1小时。
8. 洗涤同步骤2。
9. 加邻苯二胺底物200μl，室温避光反应10-15分钟。
10. 加终止液50μl。
11. 用酶联免疫检测仪在490nm波长读取吸光度值，记录结果。
总结：ELISA作为一种灵敏、特异的免疫检测技术，广泛应用于临床诊断、科研及疫苗开发中。其关键在于酶标记物的选择与制备、底物的选择及操作步骤的规范，确保检测结果的准确性和重复性。