蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种广泛应用于生物化学和分子生物学领域的蛋白质分离技术。

一、实验目的

1. 了解SDS-PAGE的基本原理。

2. 掌握电泳实验的操作流程和注意事项。

3. 利用电泳技术测定蛋白质的分子量。

二、实验原理

SDS-PAGE采用不连续缓冲系统，最早由Ornstein和Davis于1964年设计。样品和浓缩胶中含有Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），上、下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH 8.3），分离胶中含Tris-HCl（pH 8.8）。所有缓冲液中均含有0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）。

在该系统中，氯离子形成移动界面的先导边界，甘氨酸分子则组成尾随边界。移动界面之间形成电导较低、电位梯度较陡的区域，推动蛋白质样品前移并在分离胶前沿积聚。此处pH较高，有利于甘氨酸的离子化，甘氨酸离子穿过堆积的蛋白质，紧随氯离子之后沿分离胶泳动。

SDS与蛋白质结合后，使蛋白质构象发生改变，形成形状近似雪茄烟形的长椭圆棒状复合物。不同蛋白质的SDS复合物短轴长度相同（约1.8纳米），长轴长度与蛋白质分子量成正比。因此，SDS-PAGE中蛋白质的迁移率主要取决于其分子量，而不受原有电荷和形状影响。

在SDS和巯基乙醇的作用下，蛋白质完全变性并解聚为亚基或单肽链，测定结果反映的是蛋白质亚基的分子量。

聚丙烯酰胺凝胶的孔径由丙烯酰胺浓度和交联剂（双丙烯酰胺）比例决定。无交联剂时，丙烯酰胺形成粘稠溶液无分离效果。交联剂提高凝胶刚性和抗张强度，形成蛋白质复合物必须通过的小孔。孔径随交联剂与丙烯酰胺摩尔比增加而减小，通常配比为1:29，能分离分子量相差仅3%的蛋白质。

不同浓度丙烯酰胺凝胶的线性分离范围如下：

三、实验材料与试剂

1. 丙烯酰胺和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺：配制29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）交联剂的储存液，pH不超过7.0，避光保存，定期更换。注意其神经毒性，操作时避免皮肤接触。

2. 十二烷基硫酸钠（SDS）：配制10%（w/v）储存液，室温保存。

3. Tris缓冲液：用于制备分离胶和浓缩胶。

4. TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合反应。

5. 过硫酸铵：新鲜配制，提供自由基。

6. 1.5M Tris，pH 8.8（分离胶缓冲液）。

7. 1M Tris，pH 6.8（浓缩胶缓冲液）。

8. Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸，pH 8.3，含0.1% SDS。

9. 样品处理液：50mM Tris-HCl（pH 6.8），100mM DTT或5%巯基乙醇，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。

10. 染色液：0.1%考马斯亮蓝R250，40%甲醇，10%冰醋酸。

11. 脱色液：10%甲醇，10%冰醋酸。

四、实验步骤

1. 配制所需的SDS聚丙烯酰胺凝胶各类试剂。

2. 凝胶灌制：根据丙烯酰胺浓度配制分离胶溶液，加入TEMED后迅速混匀并倒入玻璃板间，待聚合完成后加入浓缩胶。

3. 样品准备：将蛋白样品与样品缓冲液混合，煮沸变性后冷却上样。

4. 电泳运行：在适当电压下进行电泳，直至染料前沿达到凝胶底部。

5. 染色与脱色：用考马斯亮蓝染色，脱色至背景透明，显现蛋白条带。

本技术因其高分辨率和准确的分子量测定能力，成为蛋白质分析的标准方法之一。