免疫细胞化学常用试剂介绍

免疫细胞化学是一种通过抗原-抗体特异性结合来定位细胞或组织中特定分子的技术。试剂的选择和使用对实验结果的准确性和重复性至关重要。本文系统介绍了免疫细胞化学中常用的固定剂、缓冲液、显色液、粘附剂、封固剂及酶消化液的配制方法及应用特点，旨在为科研人员提供详尽的参考。

一、固定剂

固定剂用于保持组织或细胞的结构完整性及抗原性。不同的固定剂对蛋白质和肽类抗原的保存效果不同，选择时需结合研究对象的化学性质。

1. 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）
适用于光学显微镜免疫细胞化学，温和且适合长期保存。制备时将多聚甲醛溶于磷酸缓冲液中加热溶解，pH调节至7.3。

2. 4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠缓冲液
适合光学及电镜免疫细胞化学，必要时可加入0.5%～1%戊二醛增强固定效果，适合长期保存。

3. Bouin’s液及改良Bouin’s液
由饱和苦味酸、甲醛和冰醋酸组成，固定效果好但酸性较强，可能损伤抗原且导致组织收缩，不适合长期保存。

4. Zamboni’s液
适用于电镜免疫细胞化学，能较好保存超微结构和抗原性，常用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸混合配制。

5. PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）
适合富含糖类组织，利用过碘酸氧化糖类形成醛基，通过赖氨酸与醛基交联固定抗原，兼顾抗原稳定性和位置关系。

6. Karnovsky’s液（pH7.3）
含多聚甲醛和戊二醛，适合电镜免疫细胞化学，短时冷固定有助于保存抗原性和细微结构。

7. 0.4%对苯醌
对抗原有保护作用，常与醛类固定剂混合使用，但对超微结构保存有一定影响，且具有毒性，使用时需注意安全。

8. PFG液（对苯醌-甲醛-戊二醛固定液）
结合了对苯醌、甲醛和戊二醛的优点，阻止醛基对抗原的损害，适合多种抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜研究。

9. 碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液
适合培养细胞的电镜免疫细胞化学，能较好保存超微结构和抗原定位。

10. 四氧化锇（OsO4）
电镜研究必需的后固定剂，主要固定脂类，也能与蛋白质和肽类交联，增强电子密度，便于电镜观察。

二、缓冲液

缓冲液用于维持实验环境的pH和离子强度，常用的有：

1. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PB，pH7.4）
由NaH2PO4和Na2HPO4按比例混合配制，常用于固定液和蔗糖溶液的配制。

2. 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）
用于漂洗组织和稀释血清，pH应保持在7.25～7.35。

3. Karasson–Schwlt’s磷酸盐缓冲液
用于配制Zamboni’s固定液。

4. 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.6）
用于配制TBS和DAB显色液。

5. Tris缓冲生理盐水（TBS）
常用于免疫酶技术中的标本漂洗。

6. Tris-TBS（含Triton X-100）
用于稀释血清和漂洗标本，Triton X-100增加细胞膜通透性。

7. 0.1mol/L二甲胂酸缓冲液
用于特定固定液的配制。

三、显色液

显色液使抗原-抗体复合物可视化，常用的有：

1. DAB显色液
用于免疫过氧化物酶法，终产物呈棕色，适合光镜和电镜观察，操作时需注意DAB的致癌性。

2. 4-氯-1-萘酚显色液
终产物呈蓝色，适合免疫组化，需避免酒精脱水以防沉淀溶解。

3. 3-氨基-9-乙基卡唑（AEC）显色液
阳性部分呈深红色，需用甘油封固。

4. TMB显色液
反应产物为深蓝色，适合HRP及HRP-WGA神经投射研究，具有较低检测阈值，操作时需注意安全防护。

5. NBT显色液
与BCIP结合，在碱性磷酸酶作用下形成蓝紫色沉淀，适合酶标记技术。

四、粘附剂

用于防止组织切片脱落，常用的有：

1. 铬矾明胶液
通过加热溶解明胶和铬矾制备，适合玻片包被。

2. 甲醛-明胶液
明胶溶解后加入甲醛，增强粘附效果。

3. 多聚赖氨酸（PLL）
非蛋白质粘附剂，溶于水后使用，适合多种组织。

4. Vectabond试剂
通过化学修饰玻璃表面，增强组织切片的粘附力，适合长期保存。

五、封固剂

用于保护染色标本，常用的有：

1. 甘油-TBS及甘油-PBS
混合后静置去除气泡，适合封片。

2. 甘油-明胶冻
含明胶和香草酚，防腐效果好。

3. 液体石蜡
杂质少，适合荧光组化和免疫荧光封片。

4. DPX
中性封固剂，染色均匀但组织收缩明显，使用时注意稀释比例。

六、酶消化液

用于暴露抗原，解除过度固定引起的抗原掩蔽：

1. 0.1%胰蛋白酶
常用消化液，温度37℃，时间5～30分钟。

2. 0.4%胃蛋白酶
消化时间约30分钟。

3. 0.06% Pronase
用于特定组织的抗原暴露。

七、其他试剂及注意事项

蔗糖溶液用于防冻和脱水，Triton X-100作为非离子表面活性剂增加细胞膜通透性，甲醇-H2O2液用于封闭内源性过氧化物酶活性。实验中应根据抗原性质和实验需求合理选择试剂和条件，确保抗原性和组织结构的最佳保存。

总结：免疫细胞化学试剂种类繁多，合理选择固定剂、缓冲液、显色液等是保证实验成功的关键。本文详细介绍了各类试剂的配制方法、适用范围及注意事项，结合最新研究进展，为科研工作者提供了全面的技术支持。

（作者：吴康 周德山）