神经元培养的转染方法是研究神经生物学中基因功能和信号通路的关键技术。本文详细介绍了磷酸钙共沉淀法转染培养神经元的经典方案，由A. Ghosh、H. Dudek和M.E. Greenberg于1995年建立，至今仍被广泛引用。该方法适用于原代神经元培养，通过优化条件可获得约5%的转染效率，适用于基因过表达或沉默研究。

转染步骤：

1. 将培养基更换为预热的DMEM（保留原培养基，转染后恢复使用）。

2. 将培养板放回培养箱孵育1小时。

3. 孵育期间制备DNA沉淀（ppt）。

4. 细胞在DMEM中孵育1小时后，将DNA沉淀逐滴加入培养基表面，轻轻摇晃使其均匀分布。显微镜下应可见细沙状沉淀。

5. 将培养板放回培养箱孵育10-30分钟（具体时间需根据细胞类型经验优化）。

6. 吸除含沉淀的DMEM。

7. 用DMEM洗涤细胞2次。

8. 加入步骤1中保存的原培养基，将细胞放回培养箱。

9. 转染后1-5天内，通过适当方法检测转染基因的表达。

制备CaCl₂/DNA沉淀（以24孔板为例，每孔500 μl培养基，3 μg DNA溶于30 μl沉淀）：

制备300 μl沉淀（10孔）：

1. 制备150 μl DNA混合液：2.0 M CaCl₂ 15 μl（CaCl₂需在37°C水浴预热），质粒DNA 30 μg（溶于TE，推荐使用双带CsCl超纯质粒），无菌去离子水补至150 μl。

2. 将DNA混合液逐滴加入150 μl 2× HeBS（预热至37°C，置于超净台），同时轻轻旋涡混匀。

3. 室温避光静置10-25分钟，沉淀应比纯HeBS略显浑浊。此时即可加入细胞。

HeBS配方（2升）：

NaCl 32 g，KCl 1.42 g，Na₂HPO₄·7H₂O 0.76 g，D-葡萄糖 5.4 g，Hepes（游离酸）20 g。将各组分溶于1.8升去离子水，用10N NaOH调pH至7.05，定容至2升，复测pH（7.05-7.07），过滤除菌，分装后-20°C保存。使用前解冻单支。建议制备pH 7.05-7.09范围的HeBS各20 ml，测试转染效率。

注意事项：

1. 对于新生神经元培养，需添加犬尿喹啉酸（终浓度1 mM）以阻断谷氨酸受体，减少转染过程中的兴奋毒性细胞死亡。

2. 测试不同pH的HeBS批次，以确定最佳转染效率（推荐pH 7.05-7.09范围）。

3. 需优化沉淀与细胞接触的时间，以获得最佳结果。

4. 通常使用β-半乳糖苷酶表达质粒优化转染条件，转染后2天用Promega抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体检测产物。常规可获得约5%的转染效率。使用CMV或RSV启动子的质粒表达水平较高。

5. 若沉淀过于聚集，可降低CaCl₂浓度；若沉淀形成过慢，可提高CaCl₂浓度。