磷酸钙细胞转染技术是一种经典的将外源DNA导入真核细胞的方法，广泛应用于基因功能研究、蛋白表达及基因治疗等领域。其原理基于磷酸钙与DNA形成共沉淀复合物，该复合物通过胞饮作用被细胞摄取，进而实现DNA的细胞内释放和表达。该方法由Graham和van der Eb于1973年首次报道，后经Wigler等人优化，具有操作简便、成本低廉、适用细胞类型广泛等优点，既可用于瞬时转染，也可用于稳定转染。

实验目的

1. 了解细胞转染技术的基本原理和常用方法。
2. 掌握磷酸钙沉淀法的关键技术要点。

实验原理

磷酸钙沉淀法利用钙离子与磷酸根离子在特定pH条件下形成微细沉淀，DNA分子被包裹其中。当将DNA-磷酸钙共沉淀物加入细胞培养液中时，沉淀颗粒附着于细胞膜表面，通过胞饮作用进入细胞质，部分DNA可进入细胞核并整合至宿主染色体，实现稳定表达。该过程受DNA浓度、钙离子浓度、pH值、沉淀时间及细胞状态等多种因素影响。

仪器、材料和试剂

1. 呈指数生长的真核细胞（如HeLa、BALB/c 3T3、NIH 3T3、CHO或鼠胚胎成纤维细胞）。
2. 完全培养液（根据所用细胞系选择）。
3. CsCl纯化的质粒DNA（10～50 μg/次转染，二次纯化）。
4. 2×HEPES缓冲盐水（HeBS）：pH 6.95～7.05，含50.0 mmol/L HEPES、280 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、1.5 mmol/L葡萄糖。用0.5 mmol/L NaOH调pH至6.95～7.05，过滤除菌，-20℃保存备用。
5. 2.5 mol/L CaCl₂：过滤除菌，-20℃保存备用。
6. 磷酸缓冲盐水（PBS）。
7. 37℃、5% CO₂的加湿培养箱。
8. 100 mm组织培养平板。
9. 15 ml锥形管。

方法与步骤

1. 传代细胞准备：转染前24 h传代，待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4 h，用9 ml完全培养液培养细胞。
2. DNA沉淀液的准备：将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50 μg/10 cm平板），空气中晾干沉淀，重悬于无菌水中，加50 μl 2.5 mol/L CaCl₂。
3. 用巴斯德吸管在500 μl 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl₂溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl₂溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少持续1～2 min。
4. 室温静置30 min，出现细小颗粒沉淀。
5. 将沉淀逐滴均匀加入10 cm平板中，轻轻晃动。
6. 在标准生长条件下培养细胞4～16 h。除去培养液，用5 ml 1×HeBS洗细胞2次，加入10 ml完全培养液继续培养。
7. 收集细胞或分入培养皿中进行选择培养。

注意事项

1. 整个转染过程需无菌操作。
2. 为获得最佳结果，DNA应不含蛋白质和酚。乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，并在无菌水或Tris-EDTA中溶解。
3. 沉淀物的大小和质量对转染成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl₂溶液时需用空气吹打，确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效粘附和进入细胞。
4. 实验中每种试剂都必须小心校准，保证质量。即使偏离最优pH值十分之一个单位，也可能导致转染失败。