3．根据红细胞在孔底的沉积类型而定。“－”，红细胞沉于管底，呈圆点形，外周光滑；“±”，红细胞沉于管底，周围不光滑或中心有白色小点；“＋”，红细胞沉积范围很小，呈较明显的环形圈；“＋＋”，红细胞沉积范围较小，其中可出现淡淡的环形圈；“＋＋＋”，红细胞布满管底呈毛玻璃状；“＋＋＋＋”，红细胞呈片状凝集或边缘卷曲。呈明显阳性反应（＋）的最高稀释度为该血清的滴度或效价。

　　目前对血吸虫病应用纯化虫卵抗原间接血凝试验。采用经SephadexG－100柱层析纯化的血吸虫卵抗原致敏红细胞作IHA，提高了方法的敏感性，特异性和重现性，为在疫区扩大应用提供了条件。

　　IHA操作简便，敏感性高，适于现场使用，可作为辅助论断病人，流行病学调查及综合查病方法。先后在多种寄生虫感染中应用，如血吸虫，疟疾、猪囊虫，旋毛虫，肺吸虫，阿米巴，弓形虫，肝吸虫等。有些已制成商品诊断药盒。不足之处是不能提供检测抗体的亚型类别，和容易发生异常的非特异凝集。另外抗原的标准化，操作方法规范化急待解决，以提高其诊断效果和可比性。

　　（五）免疫荧光法

　　免疫荧光法（immunofluorescent　method，IF）是借抗原抗体反应进行特异荧光染色的诊断技术。最常用的荧光素为异硫氰基荧光素（fluorescein 　isothiocynate，FITC）。常用于寄生虫感染的荧光抗体染色有直接法与间接法。

　　1．直接法　用于检测抗原，其缺点是每查一种抗原必须制备与其相应的荧光标记的抗体。目前很少应用。
2．间接法　也称间接荧光抗体法（indirect　fluorescent antibody 　method，IFA）。将抗原与未标记的特异性抗体（如患者血清）结合，然后使之与荧光标记的抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）结合，三者的复合物可发出荧光。本法的优点是制备一种荧光标记的抗体，可以用于多种抗原，抗体系统的检查，即可用以测定抗原，也可用来测定抗体。IFA的抗原可用虫体或含虫体的组织切片或涂片，经充分干燥后低温长期保存备用。一张载片可等距置放多个抗原位点用以同时检测多个样本或确定滴度。

　　IFA的操作步骤如下：①抗原标本：用记号笔或蜡笔将各个抗原位点围圈隔离；②在每个抗原位置滴加已稀释的血清样本或样本稀释系列，使样本液充满圈内，置湿匣37℃孵育30分钟；③用pH8.00.01mol／L PBS冲后再置同样PBS液中浸泡5分钟，不时摇动，如此2遍，然后取出吹干；④在抗原位点滴加经pH8.0PBS适当稀释的羊抗人IgG荧光抗体（每批结合物的工作浓度需经滴定），使完全覆盖抗原膜，置湿盒37℃孵育30分钟；⑤经洗涤（同③）后用0.1‰伊文思蓝液复染10分钟，然后以PBS流水冲洗0.5～1分钟，风干；⑥用pH8.5或pH8.0碳酸（或磷酸）缓冲甘油封片，也可加一小滴PBS（pH8.0）覆以盖片镜检。镜检应及时进行以免疫光衰变。可使用荧光光源或轻便荧光光源，配以适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发适合的激发滤片和吸收滤片，在低倍或高倍镜下检查。以见有符合被检物形态结构的黄绿色清晰荧光发光体、而阴性对照不可见者为阳性反应。根据荧光亮度及被检物形态轮廓的清晰度把反应强度按5级区别（＋＋＋，＋＋，＋，±，－）。＋以上的荧光强度为阳性。

　　该法具有较高的敏感性、特异性和重现性，应用抗原经济。国内外广泛应用于寄生虫病的血清学诊断方法，血清流行病学调查和监测疫情的方法，如主要用于诊断疟疾、丝虫病及血吸虫病，也有用于肺吸虫病、华支睾吸虫病、包虫病及弓形虫病的血清学诊断。

　　近10年来，国内学者对IFA进行了很多改进。李允鹤等（1984，1988）通过深入研究，确定了感染鼠肝细胞内虫卵冰冻切片为IFA较为理想的诊断抗原。该法需用荧光显微镜判断结果，限制了它的应用范围。但是应用该法时必须具备的荧光抗体，目前国内已有商品供应，这为IFA的扩大应用，提供了条件。

　　（六）对流免疫电泳试验

　　对流免疫电泳试验（counter-immunao　electrophoretic 　assay，CIE）以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速，敏感的电泳技术。

　　对流电泳较简单的扩散法和常规免疫电泳法至少敏感10～20倍，省时，省料，可用已知抗原检测抗体或相反，反应结果特异，阳性反应的可信度高，适用范围广。近年来本法的改进已试用酶或放射标记的反应配体，如酶标记抗原对流免疫电泳（ELACIE）、放射对流免疫电泳自显影术（RCIEA）等。以克服电泳技术本身不够灵敏的弱点，国内在血吸虫病、肺吸虫病免疫诊断已获良好结果。国外报道应用于阿米巴病、锥虫病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸虫病等血清学诊断。

　　（七）酶联免疫吸附试验

　　酶联免疫吸附试验（enzyme-linked　immunosorbent assay．ELISA）简称酶联试验，已广泛用于多种寄生虫感染的宿主体液（血清，脑脊液等）以及排泄分泌物（尿，乳，粪便等）内特异抗体或抗原微粒的检测。根据检测要求，试验可分多种类型，常用者有：用于检测抗体的间接法；检测IgM的双夹心法；检测抗原的双抗体夹心法；以固相抗体检测抗原的竞争法以及竞争抑制法等（图21－8）。

图21－8　酶联免疫吸附试验常用方法示意图

　　酶联试验的方法根据所用载体、酶底物系统、观察反应结果等不同而有很大差别。目前最常用的固相载体为聚苯乙稀微量滴定板，具有需样少，敏感，重演性好，使用方便等优点。酶底物系统也有多种，常用的有辣根过氧化物酶－邻苯二胺（HRP－OPD）、碱性磷酸酯酶－硝酚磷酸盐（AKP－PNP）等，具有较好的生物放大效应。其中HRP由于价廉、易得而被广泛应用。

　　酶联试验的基本操作过程可分为：①固相包被；②温育洗涤；③加样；④酶结合物反应；⑤底物显色；⑥终止反应读取结果等若干步骤。温育和洗涤需贯穿在每二步骤之间，用以去除多余的反应物。以下为临床上最常用的间接法（检测抗体）和双抗体夹心法（检测抗原）的操作程序：

　　⑴间接法：

　　1）以包被液（碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液0.05mol／L，pH9.6）稀释抗原（常用5～10µg/ml），每孔0.1（或0.2）ml包被反应板，37℃湿盒温育2～3小时或4℃过夜；
2）弃去包被液，反应板用去离子水或PBS－Tween液（0.005mol／L PBS含0.05％Tween-20）冲洗3次，甩干；
3）用样本稀释液（0.05mol／L PBS含0.05％Tween-20）稀释样本（起始浓度≥100^－1），用样本稀释液（每孔0.1（或0.2）ml，温育1小时；
4）弃去样液，如上冲洗，甩干加稀释结合物（市售品常稀释至100^－1，用样本稀释液），每孔0.1（或0.2）ml，温育1～2小时；
5）如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统，每孔0.1（或0.2）ml，置暗盒室温15分钟；
6）终止反应：HRP－OPD系统每孔加1mol／LH₂SO₄50µl；
7）目测或用分光光度计在400µm波段测定吸收值来判断。

　　⑵双抗体夹心法：

　　1）以包被液稀释抗体（如兔抗血吸虫虫卵可溶性抗原的抗体，抗SEA－IgG）包被反应板（1～1000µg/ml），方法同间接法包被抗原；
2）冲洗，甩干，加样温育同前（起始浓度≥5^－1）；
3）加结合物（例如抗SEA－IgG－HRP），适宜工作浓度需先经方阵滴定确定；
4）以下各步同间接法。

　　若包被抗体与第二抗体来自不同种的供体则可应用市售抗免疫球蛋白结合物。例如包被抗体为羊抗SEA，二抗用兔抗SEA则在未标记的二抗温育洗涤后加羊抗兔IgG结合物（GAP－HRP）。

　　[附]酶标记物制备：应用抗原或抗体与酶分子的交联技术，交联物亦称酶结合物（conjugate）。根据酶与抗体（抗原）的激活顺序，交联反应可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的过碘酸钠法多用，戊二醛一步法反应率较低，较适用于交联AKP。免疫球蛋白标记辣根过氧化物酶（过碘酸钠法）与免疫球蛋白标记碱性磷酸脂酶（戊二醛一步法），按常规方法制备。

　　抗IgG型抗体酶结合物也可用金黄色葡萄球菌A－蛋白酶结合物替代，称A－蛋白酶联试验（SPA－ELISA）。A－蛋白辣根过氧化物酶结合物（PA－HRP）已有市售标准品，其敏感度稍逊于抗体酶结合物。

　　底物配制：不同的酶要求选择相应底物，以下为分别适用于比色和肉眼读取结果的两种HRP常用底物配制。

　　邻苯二胺（OPD）：经HRP催化后生成橘红色产物。40mgOPD溶于柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.0）100ml（含24.3ml 0.1mol／L柠檬酸，25.7ml0.02mol／L Na₂HPO₄加水50ml），临用前加30％H₂O₂0.15ml，温育15分钟后用2mol／l H₂SO₄终止反应，492nm读数。本底物具高度敏感性，显色梯度良好，生成可溶性产物，有利于比色读数，但为光敏感，反应时应置暗盒内；也具致突变作用。

　　5－氨基水杨酸（5AS）：经HRP催化生成棕色产物。8mg5AS溶于10ml50℃温热蒸馏水中，置4℃暗处不超过3天，临用前以1n NaOH调pH至6.0，加0.05％H₂O₂ 1ml。37℃经30～60分钟温浴后用1n NaOH终止反应，肉眼或449nm比色。本底物无致突变作用，生成棕褐色不全溶解的产物有利于肉眼判读结果。

　　酶联试验为高灵敏检测技术，结果可定量表示，可检测抗体、抗原或特异性免疫复合物，微量滴定板法消耗样本试剂少，能供全自动操作，适用批量样本检测，因此在寄生虫感染的研究和诊断领域乃至血清流行病学均被广泛应用。国内外有多种寄生虫感染的酶联药籍出售，包括有血吸虫病、弓形虫病、阿米巴病、丝虫病、蛔虫病、旋毛虫病和犬蛔虫病等，ELISA可用作辅助诊断病人，血清流行病学调查和监测疫情的方法。酶联试验操作程序的简单快速不如IHA，但方法具有很大所改良潜力和适应范围。判断结果需用分光光度计，限制了扩大应用；另外，应用抗原及酶结合物尚需进一步标准化，操作方法也应规范化。

　　近年来已有多种改进的酶联免疫吸附试验如①快速－ELISA：改进特点为用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反应板作载体；将1％可溶性血吸虫卵抗原与尿素溶解性血吸虫卵抗原等量相混合预吸附于薄膜上；用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制备酶结合物；用底物TMB代替OPD。该法主要以目视法判断结果，整个操作流程仅需20min左右。②硫酸铵沉淀抗原－ELISA：可溶性血吸虫卵抗原经饱和硫酸铵沉淀后用作ELISA诊断抗原；在系列实验基础上，使操作方法达到规范化；用质量控制图控制检测差异，并以标准曲线单位判断结果；缩短检测时间，节省检测时间，节省试液用量，提高了敏感性，特异性和重现性。

　　（八）斑点ELISA

　　斑点ELISA（dot-ELISA）是近年新发展的一种ELISA技术，选用对蛋白质有很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体，底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色，然后目测或用光密度扫描仪定量。dot-ELISA可用来检测抗体，也可用来检测抗原，由于该法检测抗原时操作较其他免疫学试验简便，故目前多用于抗原检测。

　　操作方法将待检血清作1:1～1:20稀释，用微量加样器将1µl血清点滴于硝酸纤维素膜（NC）上，置于70℃经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中，室温摇荡1小时，洗涤2次，加1：1000稀释的McAb酶标记物，室温摇荡2小时，洗涤3次后，加底物3，3'二氨基联苯胺或4氯－1－乙萘酚，15分钟后，流水终止反应，以目视法判断结果。凡显示棕色斑点者为阳性，否则为阴性。以产生棕色斑点反应的最高稀释度为抗原滴度。

　　该法简易，快速，适合于现场应用，有广阔的应用前景。现有的资料初步证明具有诊断病人和考核治疗效果，国内已用于血吸虫病，疟疾，丝虫病，棘球蚴病的诊断。国内学者曾比较斑点ELISA和双抗体夹心ELISA用于检测班氏丝虫病人循环抗原。采用相同的单克隆抗体和病人血清进行两种方法对比试验。结果显示两种方法检测的特异性均大于95％，但是它们的敏感性有明显不同，斑点ELISA能检测出血清中0.055ng/ml微丝蚴抗原，而双抗体夹心ELISA仅能测出≥10ng/ml抗原；并且前者不需要特殊的设备，适用于丝虫病流行区。另有报告用单克隆抗体－抗原斑点试验（McAb-AsT）检测血清抗原诊断黑热病，效果较为满意，方法上进一步简化，加样以原浓度血清反应，效果最佳。国外还用于旋毛虫病、丝虫病、弓形虫病以及肺孢子虫病的血清学诊断方法。