（九）免疫酶染色试验

　　免疫酶染色试验（immunoenzymic　staining　test，IEST）是以含寄生虫病原的组织切片，印片或培养物涂片用作抗原进行过氧化物酶特异免疫染色后在光镜下检示样本中的特异性抗体。在蠕虫和原虫感染中均有多种应用。

　　操作过程抗原组织作冰冻（5～10µm）或石蜡连续切片（4～8µm）排列于载玻片，经丙酮固定贮存于－20℃备用。原虫纯培养亦可制成分隔涂片，方法均同荧光染色法抗原制片。试验时先将抗原片在稀释的过氧化氢溶液浸泡15分钟，除去可能存在于组织中的内源性过氧化物酶；抗原片用PBS冲洗后经Tris缓冲液（PBS，pH7.6）10倍稀释的正常兔或羊血清培育10分钟，迅速以PBS洗涤后加检测样本（单个或系列稀释度），置湿盒室温（20～25℃）或37℃培育30分钟；PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加兔或羊抗人过氧化物酶结合物（参照ELISA法），结合物中可加入所用抗原组织片供体动物血清约1／25～1／3体积，用以阻断可能交叉反应，降低背景色度；抗原片以PBS洗涤3次后加联苯胺（DAB）底物溶液（饱和联苯胺液加等量pH7.6硼酸缓冲液，用前按9:1体积加入0.1％H₂O₂液），室温显色10～15分钟后在光镜下观察反应结果。

　　反应标准：“－”，组织内抗原部位不呈现棕红色；“＋”，组织内抗原部位（如血吸虫肝卵切片中的虫卵）呈现棕红色；“＋＋”，局部呈现清晰的棕红色；“＋＋＋”，呈现非常清晰的棕红色。

　　该法简单，节省抗原；判断结果不需要特殊仪器；适合于现场应用。IEST可用作辅助诊断病人，考核疗效，血清流行病学调查及监测疫情的方法。目前主要应用于血吸虫病、丝虫病及囊虫病诊断，也可用来诊断华支囊吸虫病、肺吸虫病、包虫病和弓形虫病。

　　目前对该方法改进有：①用感染鼠肝组织内虫卵制成7µm厚度冰冻切片（或石蜡切片）作为诊断用固相抗原代替可溶性血吸虫卵抗原作IEST，具有取材容易和应用抗原经济的优点。②将冰冻切片置于载玻片上，可以反复使用载玻片，较一次性用的PVC薄膜／苯氯乙烯反应板价廉，显著地降低了检测费用。③判断结果时，应用普通光镜即可。染色标本不必即时检查。可保存很长时间，便于复查。④阳性血清作最高滴度，可定量抗体水平，用作考核疗效有及防治效果的指标。⑤IEST的反应基本原理与COPT相似，但前者应用切片虫卵代替了COPT的整个干卵，前法的反应快速（约1.5～2小时）而后法较缓慢（需48～72小时）。为此，IEST弥补了COPT诊断时，漏检病人和取得结果不快速的缺陷。病鼠肝组织内虫卵冰冻切片抗原IEST，目前已在疫区扩大应用。现已研制成试剂盒，批量生产，供应现场需用。

　　（十）免疫印渍试验

　　免疫印渍试验（immunoblot或Western　blot）是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术（immuno-probing 　technique），是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法，近年已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型。是为一项高敏感和高特异的诊断方法，具有很大发展潜力。用于诊断的免疫印渍试验以采用酶标记的探针（即二抗及其标记结合物）为安全方便，称酶免疫转移印渍试验（enzyme 　immuno-transfer　blotting，EITB）。

　　1．操作程序（以血吸虫EITB为例）

　　⑴样本分离：

　　1）取日本血吸虫新鲜成虫按5～10对／1.5ml比例加样本缓冲液，匀浆，置沸水浴2分钟，离心（10000g，30分钟），取上清液备用。
2）上述成虫抗原样本进行单梳SDS－PAGE电泳分离。左侧梳孔加标准分子量蛋白，梳孔右侧样槽加抗原液，电压控制在160～180V之间。

　　⑵电泳转印：

　　1）从电泳板中取出已完成电泳的凝胶片浸泡于盛有转印缓冲液（TB）的搪瓷盘　内。
2）在TB液内组成转印夹心板层：取相应大小的硝酸纤维（NC）薄膜，徐徐浸泡在TB液，将凝胶片与薄膜光面紧贴。两面各放置浸湿滤纸两层而后海绵垫（厚0.5～1cm）一层，做好方位标记，最后夹于二层有孔塑料衬板之间，绝对避免各层之间留有气泡。
3）将TB倒入转印槽中，然后插入转印板，使凝胶片位于阴极侧，NC薄膜位于阳极侧。
4）置转印槽于4℃冰箱内，通电转印数小时或过夜，电流控制在250mA上下（约40～50V）。

　　⑶探针检测：

　　1）取出转印好的NC薄膜，水平地放入猝灭剂中，室温摇动1小时以封闭未吸附蛋白质的区域，然后用洗涤缓冲液选2～3次，每次30分钟以除去亦性剂，使蛋白质的天然状态和生物学特性得以恢复。
2）平置NC薄膜于浸有Tris-缓冲盐水（TBS）的滤纸上，用刀片将薄膜按电泳方向分割为宽约0.5cm的直条，用铅笔做好上端标记。
3）取其中一个细条，并同标准蛋白条带一起作氨基黑染色（也可用考马斯亮蓝染或银染）测试分离效果并确定分子量位置。其余细条晾干后置4℃作印渍试验备用（抗原活性可保持3个月以上）。

　　⑷印渍试验：

　　1）置上述抗原条于分格反应板的反应槽内，正面向上，每槽一条，预先用0.05%TBS-Tween液浸湿（TBS-T）；
2）被检血清用TBS-T液稀释（常用1:150），加入反应槽中，以浸没膜条为限。通常需0.5～1.5ml，相当于10µl血样量（每槽加液量下同）；
3）室温（20～25℃）振荡60分钟，以后用TBS-T洗6次，每次3分钟；
4）加已稀释的羊抗人酶结合物，温育1.5小时，洗涤如上；
5）加入新鲜配制的底物溶液（TBS50ml+0.3%萘酚甲醇液3ml+30%H₂O₂10µl；或二氨基联苯胺，DAB，5mg/ml 0.05mol/L柠檬酸磷酸缓冲液，pH5.0，每60ml加3%H₂O₂20ul和1%COCl₂0.2ul 和1%COC1₂0.6ml）；
6）15分钟后用蒸馏水冲洗数次以终止反应，薄膜条取出置玻板自然干燥；
7）阳性反应可见蓝黑色（4氯1萘酚底物）或棕褐色（DAB）条带。

　　2.主要试剂

　　⑴样本缓冲液：含甘油10ml，2-巯基乙醇5ml，10%SDS30ml。
⑵转印缓冲液（TB）：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，水加至1000ml。
⑶Tris缓冲盐水（TBS）：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1调pH至7.4。
⑷TBS-T液：TBS液内含0.05%Tween-20于TBS液。
⑸猝灭剂：1%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20于TBS液。
⑹氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470），45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。

　　脱色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。

　　EITB用作鉴定寄生虫抗原的特定组分蛋白及诊断寄生虫病的方法。在国外已成功地用于艾滋病的常规诊断，并且在疟原虫、弓形虫、血吸虫、肺吸虫、包虫等的研究分析方面有很多报道。国内用于检测包虫病患者血清抗体也获良好结果，初步应用于血吸虫感染现场调查，用上述抗原及操作程序可检示特异的抗肠相关31/32kD诊断蛋白抗体的条带，呈现特异和敏感的特性。用本法对感染宿主不同病期抗体谱型的研究，可望获得有效化疗后早期隐退的特异条带。批量制备抗原分离的薄膜条带，有可能成为适用于现场查病的特异性诊断药盒，不铁为一项具有诊断潜能的新技术。

　　（十一）杂交瘤技术制备单克隆抗体

　　经十多年的研究，单克隆抗体（McAb）广泛用于寄生虫病临床与实验研究。如寄生虫虫种与虫株的分型和鉴定；建立以检测循环抗原为主的免疫诊断方法；分析和纯化抗原制备靶抗原；以及寄生虫感染免疫，保护性免疫和虫苗制备等方面，目前，国内外有报告，McAb用于疟疾、弓形虫病、血吸虫病、肺吸虫病、棘球蚴病、丝虫病等方面。有关McAb在疟疾中的应用，如对虫种，虫株的鉴定与分型，通过采用McAb对环孢蛋白（circumsporozoite 　protein，CSP）抗原及裂殖体糖蛋白研究，为疟原虫分型鉴定提供了新的依据；单克隆抗体的应用又为提高临床免疫诊断价值提供了极好的工具，近年来，国内已有报告采用McAb双夹心斑点金银染色法和双夹心斑点酶联免疫吸附试验以检测疟原虫循环抗原，阳性率分别达90%～93.3%和85%～86.7%，具有较高的特异性和重复性，另外发现某些抗子孢子、裂殖体（子）和配子体的单克隆抗体具有保护作用。保护性McAb的发现不仅为制备虫苗的靶抗原提供了条件，而且为进行被动免疫开辟了途径。

　　在血吸虫病方面，单克隆抗体已应用于血吸虫抗原分析，免疫学诊断和保护性免疫研究，国内外均已报道采用检测血吸虫循环抗原，如Sj23，Sm38，Sj70等抗原，其阳性率在90%～97%，交叉反应低且有良好的疗效考核价值，有关保护性免疫研究方面，主要集中在分子量分别为28kD和38kD的抗原，现有资料初步表明以McAb提纯的28kD抗原免疫大白鼠后，可获得70%的保护率。

　　在丝虫病方面，应用杂交瘤技术已制备出识别马来微丝蚴表面分子量分别为70kD、75kD、110kD等抗原的McAb，某些McAb能介导巨噬细胞粘附于微丝蚴表面，引起虫体死亡。将这些McAb被动转移给受体动物，在体内能降低微丝蚴血症。

　　（十二）DNA探针技术

　　DNA技术（probe）技术，又称核酸分子杂交（molecular 　hybridization）技术，最近几年迅速发展起来的一种敏感性高，特异性强，应用面广的研究手段。在寄生虫病诊断中，探针是病原体的特异核酸序列，可用来检测出病原体是否存在，其关键环节在于获得特异的核酸探针。近10年来应用特异的核酸探针鉴定寄生虫和诊断寄生虫病的研究报道较多，现有资料表明，DNA探针检测，其特异性和敏感性高；并且DNA探针是直接检测寄生虫的基因，故比血清学方法可靠；又因探针DNA较稳定，在合适条件下可较长期保存；在试验条件不变时试验结果的重演性较好。在寄生虫病的诊断、现场调查、寄生虫种的鉴定及分类等方面的研究中均已使用了DNA探针技术，内容包括原虫、吸虫、线虫、绦虫、昆虫的鉴定和致病的诊断。另外，核酸探针已成功地用于许多传播媒介体内寄生虫的鉴定。但是一般尚在实验阶段。可望能用作高效和准确的寄生虫病血清学方法，用以制备经济和理想的诊断抗原。

　　（十三）PCR技术

　　检测病原体遗传物质用以诊断寄生虫病的方法，除分子杂交技术外，新近发展的更灵敏、快速，并且不需要同位素标记的基因扩增技术，如聚合酶链反应（polymerase 　chain　reaction，PCR）是一种体外扩增特异性DNA技术。

　　现已使用PCR技术于寄生虫病诊断，如锥虫病、利什曼病、肺孢子虫病、肠球虫病、贾第虫病、弓形虫病等，在一些疾病中，有时原虫数量极少，用一般方法无法检测，经用PCR扩增DNA模板，提供了一条解决诊断的途径。如在检测锥虫时，PCR扩增纯化DNA可使探针检测到血样中1个虫体；国内建立了弓形虫病PCR诊断方法，具有高度特异、敏感且快速的优点。今后在寄生虫学领域中将会更广泛深入地开展PCR技术的应用。

（石佑恩）