在分子生物学和基因工程研究中，将外源DNA导入受体细菌是核心技术之一。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化实验是实现这一目标的基础方法。本指南详细介绍了利用氯化钙（CaCl₂）法制备感受态细胞并进行质粒转化的完整流程，包括原理、材料、步骤及注意事项，旨在为实验室操作提供清晰、可靠的参考。

一、实验原理

转化（Transformation）是指将外源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的过程。在自然条件下，许多质粒可通过细菌接合作用转移，但人工构建的质粒载体通常缺乏mob基因，无法自行转移。因此，需诱导受体细菌产生感受态（Competence），即细胞膜通透性暂时改变，以摄取外源DNA。常用的感受态制备方法包括CaCl₂法和RbCl（KCl）法。CaCl₂法操作简便，转化效率可满足一般实验需求，制备的感受态细胞可加入15%无菌甘油于-70℃保存半年，因此应用广泛。

二、材料与设备

材料：E. coli DH5α菌株（R⁻, M⁻, Amp⁻）；pBS质粒DNA（含氨苄青霉素抗性基因Ampʳ）；无菌离心管、培养皿等。

设备：恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、微量移液枪。

试剂：LB液体和固体培养基；氨苄青霉素（Amp）母液（50 mg/mL）；含Amp的LB固体培养基（终浓度50 μg/mL）；0.05 mol/L CaCl₂溶液（无菌）；含15%甘油的0.05 mol/L CaCl₂溶液（无菌）。

三、操作步骤

1. 受体菌培养

从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时至对数生长后期。将菌液以1:100-1:50比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD₆₀₀ ≈ 0.5（细胞密度约5×10⁷个/mL）。

2. 感受态细胞制备（CaCl₂法）

（1）将培养液转入离心管，冰浴10分钟，4℃下3000 g离心10分钟。

（2）弃上清，加入10 mL预冷的0.05 mol/L CaCl₂溶液轻轻悬浮细胞，冰浴15-30分钟，4℃下3000 g离心10分钟。

（3）弃上清，加入4 mL预冷的含15%甘油的0.05 mol/L CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰浴数分钟，即成感受态细胞悬液。

（4）分装成200 μL/份，-70℃保存（可保存半年）。

3. 转化

（1）从-70℃取出感受态细胞，室温解冻后立即置冰上。

（2）加入pBS质粒DNA（≤50 ng，体积≤10 μL），轻轻混匀，冰浴30分钟。

（3）42℃水浴热激90秒（或37℃水浴5分钟），迅速置冰上冷却3-5分钟。

（4）加入1 mL LB液体培养基（不含Amp），37℃振荡培养1小时，使细菌恢复生长并表达Ampʳ基因。

（5）取100 μL菌液涂布于含Amp的LB平板上，正面向上放置30分钟，待菌液吸收后倒置，37℃培养16-24小时。

对照设置：

对照组1：以无菌双蒸水代替DNA溶液，其余操作相同，预期在含Amp平板上无菌落生长。

对照组2：以无菌双蒸水代替DNA溶液，取5 μL菌液涂布于不含Amp的LB平板，预期产生大量菌落。

4. 转化率计算

统计每个培养皿中的菌落数。

转化子总数 = 菌落数 × 稀释倍数 × 转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积

转化频率（转化子数/μg质粒DNA）= 转化子总数 / 质粒DNA加入量（μg）

感受态细胞总数 = 对照组2菌落数 × 稀释倍数 × 菌液总体积 / 涂板菌液体积

感受态细胞转化效率 = 转化子总数 / 感受态细胞总数

四、注意事项

1. 细胞生长状态：使用新鲜活化的菌株，避免多次转接或4℃储存的培养菌。OD₆₀₀控制在0.5左右，密度过高或过低均影响转化效率。

2. 质粒质量：优先使用超螺旋态DNA（cccDNA），DNA浓度不宜过高，体积不超过感受态细胞体积的5%。

3. 试剂纯度：CaCl₂等试剂需使用最高纯度（GR或AR），用超纯水配制，分装保存于干燥冷暗处。

4. 无菌操作：全程在无菌条件下进行，使用新离心管和tip头，所有试剂需灭菌，防止DNA酶或杂DNA污染。

5. 不同菌株和质粒的转化效率可能不同，必要时需调整涂板体积或进行梯度稀释。