小脑神经元离体培养实验方案

本方案详细描述了从新生大鼠或小鼠小脑中分离神经元并进行离体培养的步骤，适用于神经发育、细胞死亡机制等研究。以下为完整实验流程及试剂配制方法。

一、解剖与组织分离

1. 使用P8大鼠幼崽或P5小鼠幼崽，在非无菌条件下（如实验台）进行解剖。全程将组织置于冰上以保持活性。每步操作需对所有动物完成后再进入下一步。

2. 准备2管约30 ml HHGN溶液（一管用于解剖，一管用于细胞处理，保持无菌），置于冰上。装满冰盘。用乙醇浸泡消毒工具：大镊子、2把精细镊子、弯镊子、1把小剪刀和1把大剪刀。将TDn和DnB溶液置于室温解冻。

3. 分离小脑：剪下头部放入含HHGN的培养皿中。用大镊子固定鼻子，用剪刀从颈部侧面剪开皮肤和颅骨，绕过头顶，再回到颈部。掀开皮肤/颅骨瓣，用精细镊子夹取小脑，放入HHGN中。

4. 在解剖镜下用两把精细镊子剥离脑膜，不必完全去除。将每个小脑切成约4块（小鼠小脑较小可省略此步）。

二、细胞处理（无菌操作）

1. 将组织转移至15 ml离心管（使用25 ml移液管以扩大开口），用HHGN洗涤3次，每次2 ml。在室温下用5 ml TDn消化15分钟（若单个小脑可减少体积）。吸除上清，用HHGN洗涤3次，每次3 ml。

2. 加入5 ml DnB，转移至50 ml离心管。用5 ml移液管吹打至均匀（约20次）。静置5分钟去除团块，将上清转移至另一管。可选：对团块再加入5 ml DnB，更剧烈吹打（封住移液管口，吹打约10次），静置5分钟，合并上清。

3. 500 rpm离心3分钟，室温。弃上清，用10 ml培养基重悬沉淀。计数活/死细胞：例如，稀释1/10（65 μl培养基或HHGN + 25 μl 0.4%台盼蓝 + 10 μl细胞），计数10 μl。预期活细胞比例约50%。

4. 用培养基稀释细胞并接种：24孔板每孔5×10^5活细胞，0.5 ml；35 mm皿2.5×10^6，1.5 ml；60 mm皿5×10^6，3 ml；100 mm皿1.5×10^7，9 ml。24孔板接种后需剧烈左右、上下摇晃，使细胞均匀分布。无需在接种后更换培养基。在5% CO2、37°C培养。1 DIV（约24小时）时加入araC至终浓度10 μM：24孔板加10 μl 500 μM araC；35 mm皿加30 μl 500 μM araC；60 mm皿加60 μl 500 μM araC。在(3)-4 DIV时用含araC的新鲜培养基换液：60 mm皿加1 ml/3 ml，24孔板加200 μl/500 μl（可在转染后换液时进行）。

三、死亡诱导（6 DIV，也可在7 DIV进行）

用-KI溶液洗涤2次：24孔板0.5 ml，35 mm皿1.5 ml，60 mm皿2 ml。然后加入-KI或+KI溶液。

四、试剂与溶液配制

1. HHGN（500 ml）：1× HBSS 50 ml（10×，无Ca、Mg，Gibco/BRL #14180-020），2.5 mM Hepes pH 7.3-7.5（1.25 ml 1 M），葡萄糖（7 ml 2.5 M或45%），NaHCO3（2 ml 1 M），4°C储存约2个月。

2. DNAase（Boehr-Mann #104159，2000 U/mg，牛胰腺II级）：储存液4000 U/ml于H2O，无菌过滤，-80°C保存。

3. TDn：250 μl DNAase + 5 ml HHGN + 50 mg胰蛋白酶（Worthington #3703），用0.1 N NaOH调pH，无菌过滤。可大量配制，分装5 ml，-80°C保存约1个月，使用前室温解冻。

4. DnB：500 μl DNase I + 10 ml BME（Sigma #B1522）。可大量配制，分装10 ml，-80°C保存，使用前室温解冻。

5. 3 M KCl：需高压灭菌，因粘稠不易过滤。

6. BME+K（500 ml）：BME（5 mM K） + 4.1 ml 3 M KCl（额外24 mM，总K+ 29 mM）。未开封BME瓶平均523 ml。

7. 小牛血清（Hyclone #A2151）：需热灭活，无菌过滤，分装50 ml和10.5 ml，-20°C保存。

8. 培养基（CbC Med，100 ml）：BME+K 100 ml + 小牛血清10 ml + 0.2 M谷氨酰胺1 ml（新鲜） + 青霉素-链霉素1 ml。换液时加入araC至10 μM：每100 ml加40 μl 25 mM araC。最终[K+] = 26 mM。

9. -KI（100 ml）：BME（5 mM K）100 ml + 0.2 M谷氨酰胺1 ml + 青霉素-链霉素1 ml + 25 mM araC 40 μl（终浓度10 μM）。

10. +KI（每10 ml）：-KI 10 ml + 2 mg/ml胰岛素25 μl（终浓度5 μg/ml） + 3 M KCl 67 μl（额外20 mM，终浓度25 mM）。无菌过滤（若胰岛素储存液未灭菌）。

五、注意事项

通常使用P8 Long-Evans大鼠，P5-9也可成功。P5/6大鼠细胞产量显著减少，胶质细胞比例较高。已发表方案也使用Sprague-Dawley和Wistar大鼠。每只P8大鼠细胞产量约1.5×10^7。原始方案使用胎牛血清，但小牛血清效果满意。胰岛素用于维持存活，而非文献1中的IGF-1，以节约成本。尽管文献1报道在6 DIV时仅用KCl或IGF（替代血清）即可维持存活，但小鼠小脑细胞在两者同时存在时存活更好（大鼠小脑细胞仅KCl即可完全存活）。若不换液，在CbC培养基（血清+KCl）中，大鼠小脑细胞仅存活约7-9天；若在4 DIV换液一次，可存活约12天。

参考文献

1. D'Mello et al. (1993) PNAS 90, p. 10989
2. Galli et al. (1995) J. Neurosci. 15, p. 1172