描述

农杆菌转化是一种常用的植物基因工程方法，利用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源DNA导入植物细胞。本方案详细描述了农杆菌感受态细胞的制备及转化步骤。

实验步骤

1. 在YEP/链霉素+培养基中培养种子，28°C振荡过夜。

2. 取3-4 mL过夜培养的菌液加入50 mL新鲜YEP/链霉素+培养基中，振荡培养4小时（OD600≈0.5）。

3. 4000 rpm离心5分钟，4°C，收集菌体。

4. 用10 mL预冷的0.15 M NaCl重悬菌体。

5. 4000 rpm离心5分钟，4°C，收集菌体。

6. 加入1 mL冰预冷的20 mM CaCl₂（此步后得到感受态细胞C）。

7. 将200 μL感受态细胞C溶液转移至玻璃管中。

8. 加入1 μg/20 μL DNA至管中。

9. 冰上孵育30分钟。

10. 液氮冷冻细胞1分15秒。

11. 37°C水浴解冻5-6分钟。

12. 加入1 mL新鲜YEP培养基。

13. 将溶液转移至Eppendorf管中。

14. 28°C孵育2-4小时。

15. 离心5分钟，4°C，收集菌体。

16. 加入200 μL YEP培养基重悬。

17. 涂布于YEP/Km+固体培养基上。

18. 28°C培养2-3天。

配方

YEP液体和固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5。固体培养基加琼脂15 g/L，卡那霉素50 μg/mL。

准备材料

根癌农杆菌LBA4404（PC2760），0.5 M NaCl（用无菌去离子水稀释至0.15 M），20 mM CaCl₂，0.22 μm滤膜过滤装置，玻璃管，蓝色和黄色枪头。

提示

所有操作需在无菌条件下进行，感受态细胞应现制现用或-80°C保存。