该方法利用植物组织打印技术,将可溶性分子转移到膜上,用于筛选可溶性蛋白质、糖蛋白、多糖、糖脂、核酸和酶活性等。通过使用不同的膜,可以固定这些分子。使用多克隆和单克隆抗体、核酸探针、酶底物、标记配体和标记凝集素等试剂对膜进行探测。
实验步骤如下:
1. 将拟南芥种子播种在60孔种子托盘中,每孔一粒。播种前浇水,种子悬浮在水中,用移液管逐一转移。盖上塑料盖,直到发芽前不再浇水。
2. 在22℃、相对湿度50%、16小时光照的受控环境室中培养植物。
3. 6周后,使用花茎进行组织打印。
4. 将硝酸纤维素膜浸泡在0.2 M CaCl2中并晾干(每种抗体使用1厘米宽的条带)。
5. 在第一和第二节之间切断花茎,将其牢固地按在硝酸纤维素膜上2秒,每条重复三次。如果制作多条用于不同抗体的探测,在打印下一条之前,在茎上切出一个新的切面。
6. 将条带放入封闭液中,在室温下摇晃孵育1小时,以封闭硝酸纤维素膜上的所有蛋白质结合位点。
7. 用含有抗体的封闭液(20倍稀释的鼠杂交瘤细胞培养上清液)替换封闭缓冲液,在室温下摇晃孵育2小时。
8. 去除一级抗体溶液,将条带浸泡在PBS中30分钟,每10分钟更换一次PBS。
9. 去除PBS,加入2000倍稀释的抗鼠IgG辣根过氧化物酶偶联物(在无叠氮化物的封闭缓冲液中),在室温下摇晃孵育1小时。
10. 去除二级抗体溶液,将条带浸泡在PBS中30分钟,每10分钟更换一次PBS。
11. 去除PBS,加入HRP底物溶液,在结合位点处产生蓝色反应,颜色应在5分钟内显现。
12. 用ddH2O彻底清洗条带。
13. 干燥条带,在解剖显微镜下观察。
相关试剂配方:
PBS(pH 7.2):1.8 mM KH2PO4,4.3 mM Na2HPO4,2.7 mM KCl,137 mM NaCl。
封闭液:0.1% (w/v) 叠氮化钠,pH 7.2,2.7 mM KCl,4.3 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4,137 mM NaCl,10% (v/v) 羊血清。
0.2 M CaCl2。
HRP底物:使用前立即配制,30 μl过氧化氢,5 ml 3 mg/ml 4-氯-1-萘酚(溶于甲醇),25 ml ddH2O。