本实验方案描述了一种从菠菜叶中分离叶绿体的简单步骤。

实验步骤

1. 准备一个冰浴，并将所有要使用的玻璃器皿（包括研钵和研杵）预冷。

2. 选择几片新鲜的菠菜叶，去除大叶脉，称取4克去叶脉的叶组织。

3. 用刀和砧板尽可能将组织切碎。

4. 将组织加入含有15毫升研磨液的冰冷研钵中，研磨至糊状。

5. 将研磨后的组织悬浮液通过双层纱布过滤到烧杯中，并挤压组织以回收所有液体悬浮液。

6. 将绿色悬浮液转移到冷的50毫升离心管中，以200倍g在4℃下离心1分钟，以沉淀未破碎的细胞和细胞碎片。

7. 将上清液倒入干净的离心管中，再次以1,000倍g离心7分钟以沉淀叶绿体，倒出并丢弃上清液。

8. 将叶绿体重新悬浮在5毫升冷的悬浮液（或0.35 M NaCl）中，用冷的玻璃搅拌棒轻轻搅碎沉淀。

9. 用铝箔包裹离心管，置于0至4℃环境中保存。

10. 使用血细胞计数板，测定每毫升悬浮介质中的叶绿体数量。

11. 要测定叶绿素含量，请参考“叶绿体中叶绿素含量的测定”实验方案。

试剂配方

悬浮液：0.33 M 山梨醇，pH 7.6（用NaOH调节），1 mM MgCl₂，50 mM HEPES，2 mM EDTA。

研磨液：0.33 M 山梨醇，pH 6.5（用HCl调节），4 mM MgCl₂，2 mM 抗坏血酸（维生素C），10 mM 焦磷酸钠。

0.35 M NaCl 溶液。

实验技巧

1. 本实验方案中的分离步骤保持了叶绿体外膜的完整性。如果需要研究光合磷酸化的酶，可以通过洗涤叶绿体并破裂外膜来实现：将叶绿体重新悬浮在稀释的悬浮液（1:25）中，立即以8,000倍g离心5分钟收集叶绿体，去除稀释的悬浮介质，并将叶绿体重新悬浮在等渗介质（0.35 M NaCl或未稀释的悬浮缓冲液）中。