本文详细介绍了使用SP6 RNA聚合酶进行体外转录的实验操作流程。所有试剂和管子应为无RNase。使用无菌蒸馏水（ddH2O）在新塑料容器中配制溶液。对NaCl、MgCl2、Tris、甘油和明胶溶液进行高压蒸汽灭菌。避免用手直接接触管盖底部或移液器尖端。

操作步骤

1. 用限制性内切酶消化线性化模板DNA。

2. 加入等体积的NETS，然后加入两倍体积的酚，通过颠倒管子混合，并在微型离心机中以最大速度离心2分钟以分离相位。回收水相，加入等体积的酚，再次离心并回收水相。

3. 加入等体积的氯仿，通过颠倒管子混合，并在微型离心机中以最大速度离心以分离相位。回收水相，加入等体积的氯仿，再次离心并回收水相。

4. 加入2.5体积的乙醇，在冰上冷藏5分钟以沉淀DNA。在4°C以最大速度在微型离心机中离心15分钟。

5. 去除上清液，用冰冷70%乙醇和0.1 M NaCl重新悬浮DNA沉淀，在微型离心机中以最大速度离心15分钟。

6. 去除上清液，用TE缓冲液溶解DNA沉淀，加入NaCl至0.2 M，加入2.5体积的乙醇。在冰上冷藏5分钟以沉淀DNA。在4°C以最大速度在微型离心机中离心15分钟。去除上清液，用70%乙醇和0.1 M NaCl重新悬浮DNA沉淀，在微型离心机中以最大速度离心15分钟。

7. 去除上清液，让沉淀空气干燥，然后用TE缓冲液溶解至0.5 mg/ml的浓度。

8. 准备转录反应混合物，包含以下成分：10 μl DNA、10 μl 10X转录缓冲液、10 μl 10X核苷酸、10 μl 5 mM m7GpppmG或GpppG、2 μl 0.5 M DTT、2 μl RNasin、5 μl 80%甘油、5 μl SP6 RNA聚合酶、46 μl水（总反应体积100 μl）。

9. 在37°C孵育反应混合物3小时。

10. 加入5 μl RQ1无RNase DNase和NaCl至0.01 M，在37°C孵育1小时。

11. 在2%琼脂糖-TAE凝胶上电泳3 μl反应混合物，以验证转录和DNase处理是否成功，观察是否出现与烟草花叶病毒（TMV）RNA标准相对应大小的RNA转录物。

12. 加入等体积的NETS，在65°C加热5分钟，然后按照步骤2-7所述的方法沉淀RNA，但用水而不是TE缓冲液重新悬浮RNA，并用20 μl ddH2O重新悬浮最终RNA沉淀。

13. 通过在凝胶上电泳1 μl最终溶液并与TMV RNA标准比较来估计RNA浓度。

配方

0.5 M DTT

80% (w/v) 甘油

乙醇/盐溶液：70%乙醇，0.1 M NaCl

NETS：0.2 M Tris-HCl (pH 8.0)，20 mM EDTA (pH 8.0)，2% (w/v) SDS，0.3 M NaCl

5 mM m7GpppmG或GpppG（储存于-70°C）

核苷酸（10X）：5 mM CTP，5 mM UTP，0.5 mM GTP，5 mM ATP（储存于-70°C）

转录缓冲液（10X）：0.05 M DTT，1 mg/ml高压蒸汽灭菌明胶，0.08 M MgCl2（储存于-20°C），0.4 M Tris-HCl (pH 7.5)

TAE缓冲液：40 mM Tris-乙酸，2 mM EDTA (pH 8.5)

TE缓冲液：10 mM Tris (pH 8.0)，1 mM EDTA