背景介绍

Matrigel是一种模拟基底膜的生物材料，源自EHS肉瘤，广泛应用于肿瘤细胞侵袭和迁移的体外模型研究。它含有基底膜的主要成分（如胶原、层粘连蛋白和蛋白多糖），以及基质降解酶及其抑制剂和生长因子，有助于模拟肿瘤细胞在体内的侵袭过程。

实验原理

通过在Transwell腔室中铺设Matrigel，观察肿瘤细胞穿越基底膜的能力，从而评估其侵袭潜能。这一方法常用于研究肿瘤细胞与细胞外基质（ECM）受体的相互作用及基质降解酶的作用，揭示肿瘤转移的机制。

操作步骤

1. 将Matrigel在4°C条件下解冻一夜，以保持其液态状态。
2. 用无血清冷培养基（如RPMI1640、EMEM或DMEM）将Matrigel稀释至1-5 mg/ml浓度。
3. 在24孔Transwell的上室加入100微升稀释后的Matrigel，轻轻铺平。
4. 在37°C条件下孵育4-5小时，使Matrigel凝固形成基底膜层。
5. 用含有1%胎牛血清（FBS）的培养基，用胰酶-EDTA消化细胞，从组织培养瓶中收集细胞。
6. 用含1%FBS的培养基洗涤细胞三次，去除杂质。
7. 将细胞重悬于含1%FBS的培养基中，浓度调整为每毫升100万细胞。
8. 用温热的无血清培养基轻轻冲洗凝固的Matrigel层，然后将细胞悬液均匀加入到Matrigel上方的腔室中。
9. 在Transwell的下室加入600微升含有5微克/毫升纤连蛋白的培养基，作为细胞粘附的底物。
10. 将装有细胞的Transwell放入37°C培养箱中孵育20-24小时，以允许细胞穿越基底膜。
11. 取出Transwell，用Diff-Quick染色液进行染色，观察侵袭的细胞数目。
12. 用棉签清除Transwell顶部未侵入的细胞，然后在光学显微镜下计数侵入细胞数量。

所需试剂与耗材

• Matrigel（Becton Dickinson）
• 24孔Transwell（Coster）
• 纤连蛋白（Sigma）
• Diff-Quick染色液（Fischer Scientific）

实验技巧

确保Matrigel在4°C保存，操作过程中保持低温，避免提前凝固；细胞悬液浓度应适中，以便准确评估侵袭能力；染色后应在显微镜下仔细计数，确保数据的可靠性。