本技术是切口平移标记法的替代方案，操作更简便，通常能获得放射性比活度更高的探针。其额外优势在于，即使DNA制备物纯度较低，也能有效工作。

步骤

1. 将20至40 μg目标DNA溶于32 μl双蒸水中，煮沸5至10分钟，然后立即在冰浴中冷却（参见提示#3和#4）。

2. 按以下体系配制标记反应：

32 μl 模板DNA
10 μl 5X寡核苷酸标记缓冲液
2 μl 10 mg/ml牛血清白蛋白
5 μl α-[32P]-dATP（3000 Ci/mmol）
1 μl（2至5单位）Klenow片段

3. 室温孵育反应3至4小时。大部分掺入发生在1小时内，并持续至约3或4小时（参见提示#5）。与切口平移不同，此后放射性不会下降。

4. 使用0.5 ml微量离心管中的小型离心柱或其他优选方法分离未掺入的核苷酸。

5. 放射性标记掺入寡核苷酸的比例通常在50%至80%之间，除非起始DNA量低于20至30 ng。比活度可达约30亿 dpm/μg DNA。

配方

α-[32P]-dATP（3000 Ci/mmol）

10 mg/ml牛血清白蛋白

5X寡核苷酸标记缓冲液（参见提示#1）：250 mM Tris-HCl, pH 8.0；250 mM MgCl2；1 M HEPES, pH 6.6；100 μM dTTP；100 μM dGTP；3 ml随机六聚体（在TE缓冲液中280 nm吸光度为90）；100 μM dATP

TE缓冲液：10 mM Tris, pH 8.0；1 mM EDTA

提示

1. 5X寡核苷酸标记缓冲液可大量配制，在-20°C保存至少一年。常规使用时，仅需使用一种放射性核苷酸。分装保存，每份解冻后反复冻融不超过一至两个月。缓冲液已包含所需的冷核苷酸，若需使用两种放射性核苷酸标记，需另行配制。

2. 注意！该物质为生物危害品。请查阅该物质的材料安全数据表（MSDS）以获取正确的处理说明。

3. 任何超过约5 ng的DNA量均可使用。理论上，20至40 ng可产生最高比活度的探针。超过100 ng的DNA会降低最终比活度。

4. 超螺旋质粒可能标记效果不佳。可通过延长煮沸步骤解决，或作为最后手段，在标记前将质粒线性化。

5. 若方便，可过夜孵育。