本文描述了一种利用PCR技术筛选L. pennellii粘粒文库的详细实验方案。该文库由MboI部分酶切的总基因组DNA经蔗糖梯度大小分级后构建，插入片段大小约为15-30 Kb，并连接至双元粘粒载体T04541。该载体含有左右边界序列、植物选择标记NPTII基因以及细菌选择标记四环素抗性基因。

实验步骤

由于菌落杂交在粘粒文库中常产生高背景，因此推荐使用PCR筛选。点杂交效果亦不佳。首先设计引物，并在L. pennellii总基因组DNA上验证能否扩增出强条带。建议将扩增条带测序以确认目标序列。

对文库的所有96个超级池进行标准PCR，每个池取1 μl作为模板。阳性对照为1 μl L. pennellii DNA，阴性对照为1 μl水。通过凝胶电泳分析PCR产物，选择与阳性对照片段大小相同的池。通常预期有3-4个阳性池。

将每个阳性池接种于3 ml LB/四环素（5 μg/ml）培养基中，37℃过夜培养。提取质粒DNA（小量制备），重复PCR验证。若观察到条带，则继续筛选。

DNA提取步骤：取2 ml培养液于离心管中，6500 rpm离心5分钟，弃上清。沉淀重悬于200 μl 25 mM Tris、50 mM葡萄糖、10 mM EDTA（pH 8），室温放置5分钟。加入400 μl新鲜配制的0.2 N NaOH/1% SDS，颠倒混匀，冰浴5分钟。加入300 μl 8 M NH4Ac，轻轻混匀，冰浴10分钟。14000 rpm离心10分钟，转移上清至新管。加入0.6倍体积（约550 μl）异丙醇，室温放置10分钟。弃上清，用1 ml 70%乙醇洗涤沉淀。14000 rpm离心5分钟，室温干燥沉淀15分钟，重悬于50 μl水中。

对阳性池进行滴度测定，以计算每个大平板（150 mm）需要涂布多少菌液以获得约4000个菌落。从甘油菌中取20 μl菌液稀释至200 μl LB中。分别取10 μl原液、10 μl 0.1×、10 μl 0.01×和10 μl 0.001×稀释液涂布于含四环素（5 μg/ml）的LB平板上（90 mm），37℃过夜培养。通常滴度结果会显示，需要涂布约50 μl的0.01×稀释液才能在大平板上获得4000个菌落。

对于每个阳性池，将菌液涂布于含四环素的大平板上，以获得约4000个菌落。同时涂布一个更高浓度和一个更低浓度作为备份。37℃过夜培养。

将含有约4000个菌落的平板切成4等份，用无菌手术刀将每份菌落刮入1 ml水中（每管代表约1000个菌落，并编号，例如阳性超级池24的4个区分别编号为24.1、24.2、24.3、24.4）。取950 μl进行DNA小量制备，并进行PCR。保留剩余的50 μl于4℃用于下一轮涂板。取10 μl PCR产物进行凝胶电泳，确定阳性区（例如24.1）。

取阳性区（24.1）剩余的50 μl菌液，取10 μl加入990 μl水（0.01×），再取10 μl加入90 μl水（0.001×），再取10 μl加入90 μl水（0.0001×）。将三个稀释度各取25 μl涂布于含四环素的大平板上，37℃过夜培养。

选择菌落数约为1000个/平板的稀释度平板，切成8等份（24.1.1, 24.1.2, ... 24.1.8），每份约125个菌落。刮取菌落至1 ml水中，保留50 μl，从950 μl中提取DNA进行PCR。确定阳性区（例如24.1.3），再次以三个稀释度涂板。

选择菌落数约为125个/平板的稀释度平板，切成8等份（24.1.3.1, ... 24.1.3.8），每份约15个菌落。刮取菌落至1 ml水中，保留50 μl，提取DNA进行PCR。确定阳性区（例如24.1.3.5），再次涂板。

选择菌落数约为50个/平板的稀释度平板，挑取30-50个单菌落分别接种于3 ml LB/四环素培养基中，37℃过夜培养。次日取2 ml培养液进行DNA小量制备，保留1 ml于4℃。通过PCR鉴定阳性克隆，并制备甘油菌。至此，已成功分离到粘粒克隆！建议至少获得两个独立超级池来源的粘粒克隆。