免疫组织化学（IHC）实验的成功依赖于对抗原特性及其与抗体识别机制的深入理解。不同抗原对固定剂和处理条件的敏感性差异显著，例如石蜡包埋过程中使用的高温和有机溶剂可能破坏某些表位，而冷冻切片的冻融过程也可能导致表位丢失。不同固定剂通过不同机制作用于组织，可能揭示或掩盖抗原表位，甚至影响抗体结合的特异性。此外，封闭剂可能与抗体非特异性结合，导致背景信号增加。因此，实验中需尝试多种技术并对比结果，最好参考已有成功使用该抗体的详细实验方案以节省时间和资源。

信号的特异性验证是免疫组织化学中的关键步骤。最简单的阴性对照是使用已知不表达目标分子RNA的组织，结合RNase保护实验和原位杂交结果确认表达区域。更严格的阴性对照包括用过量免疫原肽或蛋白预孵育抗体以消除信号。Western印迹中单一条带的出现可提示抗体特异性，但IHC条件与Western不同，可能导致信号优化不足。此外，需确认固定和透化步骤是否充分，使核抗原能被完全检测。

本协议适用于丰度较高的蛋白质检测。也可采用更敏感的方案，如使用Triton X-100透化及金氯化物/银显影增强信号。

石蜡切片处理步骤：组织取材后，使用2%多聚甲醛、Bouin液或其他固定剂固定30分钟至过夜。较大组织块需延长固定时间，固定时间影响切片质量及抗原识别。脱水过程中组织暴露于乙醇，亦具一定固定作用。切片厚度建议5-10微米。

切片先后在二甲苯中浸泡2-3次，每次10分钟；随后在100%乙醇中浸泡两次，每次2分钟；再依次在95%、70%、50%、30%乙醇中各浸泡2分钟以水化组织。

若组织内存在内源性过氧化物酶且采用辣根过氧化物酶（HRP）标记，需用0.1%过氧化氢（PBS中）或0.3%过氧化氢（甲醇中）处理以灭活内源酶，处理时间视组织类型而定。处理后用缓冲液或流水冲洗20分钟。

切片置于0.25 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中5分钟。可选步骤包括用原固定剂对切片进行短暂后固定，以减少切片脱落风险。石蜡切片操作需轻柔，避免组织边缘翘起造成抗体滞留和背景增强。

封闭步骤建议使用与二抗来源相同物种的10%血清，在湿润室室温孵育20分钟，随后用缓冲液洗涤5分钟。随后将切片置于含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2%胎牛血清的缓冲液中5分钟，抗体稀释液中应含有蛋白质以减少非特异结合。

将一抗稀释后滴加于切片，通常稀释度为1:20至1:200，具体需根据抗体特性优化。使用湿润室过夜孵育，确保抗体均匀覆盖切片湿润区域。孵育后用缓冲液轻柔冲洗，洗涤5分钟，封闭5分钟，再用二抗孵育30分钟或更长时间，随后再次洗涤。

荧光显色：二抗常标记有FITC或TRITC，洗涤后可用水溶性封片剂封片。Gel/Mount封片剂可保存切片一年以上，图像锐度略逊于DAB显色的Permount封片剂。甘油封片因光散射严重，图像质量较差。

过氧化物酶显色：根据Vectastain试剂盒说明，混合A、B液于PBS中，二抗孵育时加入，孵育1小时后洗涤，再用DAB溶液显色，观察到均匀棕色后用流水终止反应。

冷冻切片处理：参考Tyner实验室原位杂交协议，组织冷冻切片后可采用多种固定方法：室温Bouin液5分钟，4℃丙酮10分钟，-20℃甲醇15分钟，4℃2%多聚甲醛2分钟，或4℃4%多聚甲醛2分钟后70%乙醇10分钟，随后脱水。用新鲜缓冲液冲洗三次，每次2分钟，后续一抗孵育步骤同石蜡切片。