电泳迁移率变动分析（EMSA）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的经典分子生物学技术。本文详细介绍了使用双链寡核苷酸进行EMSA的实验步骤，包括缓冲液配制、寡核苷酸标记、结合反应、凝胶制备及核提取等关键环节。
一、缓冲液配制
1. 10X退火缓冲液：200 mM Tris pH 8.0，10 mM EDTA pH 8.0，500 mM NaCl，使用去离子水补足体积，室温保存。
2. 10X Klenow缓冲液：500 mM Tris pH 7.5，100 mM MgCl2，10 mM DTT，0.5 mg/ml BSA，使用去离子水补足体积，-80℃分装保存。
3. 2X结合缓冲液（参考Gutman等，GENE 110, 1992）：20%甘油，20 mM Tris pH 7.5，100 mM KCl，1 mM DTT，新鲜配制。
4. Poly dI/dC：制备1 mg/ml储备液，分装100 μl，-80℃保存。
二、寡核苷酸退火与标记
设计互补的寡核苷酸，末端含有兼容的限制酶位点（如BamHI和BglII）。将300 ng纯化的两条寡核苷酸混合，加入10X退火缓冲液，65℃水浴2分钟后缓慢冷却至冰浴中，约15-20分钟完成退火。
随后进行Klenow酶标记反应，混合退火后的寡核苷酸、10X Klenow缓冲液、dNTP混合物、放射性标记的α-32P dCTP及Klenow酶，室温孵育30分钟。反应结束后进行酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，干燥后溶于TE缓冲液中，计数放射性活性。
三、结合反应与凝胶电泳
根据实验设计制备结合反应体系，典型反应包括2X结合缓冲液、Poly dI/dC、竞争性寡核苷酸、标记探针及核提取物。室温孵育30分钟后，直接上样于预冷的非变性聚丙烯酰胺凝胶（含甘油和TBE缓冲液）中，电泳条件为4℃，200 V，约4小时。凝胶预运行及样品加载均在冷室完成以保证蛋白-DNA复合物稳定。
四、细胞核提取
采用标准核提取方案，适用于大量细胞（例如6升细胞，密度1-2×106/ml）。步骤包括：
- 细胞收获后用低盐缓冲液（Solution A）裂解细胞膜，加入蛋白酶抑制剂保护蛋白质完整性。
- 通过离心分离细胞核，使用低盐缓冲液（Solution B）洗涤核沉淀。
- 加入高盐缓冲液（Solution C）提取核蛋白，随后通过超速离心去除细胞核碎片。
- 将上清液透析至低盐缓冲液（Solution D）以去除高盐，最后液氮速冻保存。
五、HeLa细胞核制备
详细配制Chelsky缓冲液、NP-40缓冲液、CaCl2缓冲液及Buffer C。细胞收集后在4℃条件下进行多次洗涤和离心，使用NP-40和CaCl2缓冲液去除细胞膜和细胞质成分，最终获得纯净核提取物。核提取物分装冻存于-70℃。
六、寡核苷酸纯化
采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化标记的寡核苷酸，利用紫外灯进行阴影成像，切胶回收。通过氨基乙酸盐溶液浸泡、离心、过滤及乙醇沉淀步骤，获得高纯度寡核苷酸。
七、EMSA结合缓冲液及反应条件
蛋白稀释缓冲液含20 mM Tris pH 7.9，150 mM KCl，1 mM DTT，10%甘油及BSA。结合缓冲液含20%甘油，100 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM KCl，25 mM MgCl2及BSA。结合反应体积通常为20 μl，含标记DNA、Poly dI/dC及待测蛋白，室温孵育30-40分钟后进行非变性凝胶电泳。
八、放射性标记及纯化
使用T4多核苷酸激酶和32P-ATP对寡核苷酸进行末端标记，反应后通过MERMAID磁珠纯化，确保高效标记和去除未结合的放射性核苷酸。标记效率通过放射性计数器测定，通常达到2,000万至1亿cpm。
九、乙醇沉淀纯化步骤
根据样品体积选择合适离心管，加入0.1体积3M醋酸钠（pH 5.2）及2体积冷乙醇，低温过夜沉淀。离心后小心去除乙醇，使用Speed-Vac快速干燥，避免样品丢失。
总结：本文提供了EMSA实验从缓冲液配制、寡核苷酸设计与标记、结合反应、凝胶电泳到核提取的完整详细流程，适合分子生物学研究人员参考使用。该方法对研究蛋白-DNA相互作用机制、转录因子结合特异性及调控网络具有重要意义。