电泳技术是一种利用带电颗粒在电场中迁移而实现分离、鉴定或提纯的分析方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。本文系统梳理电泳技术的发展历程、基本原理、主要影响因素、分类方法及各类电泳技术的原理与应用，旨在为相关领域的研究者提供全面的技术参考。

1. 电泳技术发展简史

1809年，俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插入正负两个电极，通电后发现正极玻璃管中的水层变浑浊，表明带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年，Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为“电泳”，并利用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年，瑞典Uppsala大学的Tiselius改进了电泳仪器，创建了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明血清由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成。Tiselius因在电泳技术方面的开拓性贡献而获得1948年诺贝尔化学奖。1948年，Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，用于氨基酸分离。1950年，Durrum用纸电泳分离各种蛋白质，开创了以固体物质（如滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）为支持介质的区带电泳方法。1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），极大提高了电泳分辨率，开创了近代电泳新时代。至今，PAGE仍是蛋白质、多肽、核酸等生物大分子分析鉴定中分辨率最高的技术，被誉为“最后检查”（Last Check）。20世纪80年代发展起来的毛细管电泳技术，是化学和生化分析的重要新进展，已受到广泛重视。

2. 电泳的基本原理

电泳是指带电颗粒在电场作用下发生迁移的过程。许多生物分子（如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等）具有可电离基团，在特定pH下可带正电或负电，在电场中向相反电极移动。电泳技术利用样品中分子带电性质、大小、形状等差异，使带电分子产生不同迁移速度，从而实现分离、鉴定或提纯。电泳过程需在支持介质中进行。早期Tiselius的自由界面电泳无固定支持介质，扩散和对流强，分离效果差。随后出现固定支持介质电泳，如滤纸、醋酸纤维素膜等，减少了干扰。凝胶作为支持介质的引入极大促进了电泳技术发展，目前最常用的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。电泳装置主要包括电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场。电泳槽分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳常用于PAGE分离蛋白质；水平式电泳常用于琼脂糖凝胶电泳。电泳过程需在适当缓冲液中进行，以保持待分离物电荷稳定。带电分子在电场中受力F=qE，同时受介质粘滞力F'=6πrηυ（Stokes定律）。当匀速移动时，qE=6πrηυ，迁移率与净电荷成正比，与分子大小和缓冲液粘度成反比。SDS-PAGE中常用相对迁移率mR。带电分子因电荷和大小不同而具有不同迁移速度，形成分离区带。有些电泳（如等电聚焦）主要依赖电荷差异，有些（如SDS-PAGE）主要依赖分子大小差异。分离后样品可通过染色或放射性自显影等方法检测。

3. 影响电泳分离的主要因素

（1）待分离生物大分子的性质：分子所带电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，电泳迁移速度越快。（2）缓冲液的性质：pH影响分子解离程度，进而影响电荷量；离子强度需适中（0.02-0.2），过低缓冲能力差，过高会形成离子氛降低电泳速度；缓冲液粘度也会影响速度。（3）电场强度：电场强度越大，电泳速度越快，但电流增大导致产热增加，可能引起样品扩散、对流、蛋白变性、介质粘度降低等。需选择适当电场强度并冷却。（4）电渗：支持介质表面带电基团（如滤纸羧基、琼脂硫酸基、玻璃Si-OH）吸附反离子，在电场下形成电渗流，影响迁移速度。（5）支持介质的筛孔：孔径大小影响迁移速度，孔径大则速度快。

4. 电泳的分类

按原理分：区带电泳（最常用）、自由界面电泳（已淘汰）、等速电泳、等电聚焦电泳。按支持介质分：纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE。按支持介质形状分：薄层电泳、板电泳、柱电泳。按用途分：分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳。按电压分：低压电泳（100-500V，适于蛋白质等大分子）、高压电泳（1000-5000V，适于氨基酸、多肽、核苷酸等小分子）。

5. 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳

纸电泳以滤纸为支持介质，操作简单，用于血清样品临床检测和病毒分析。使用水平电泳槽，缓冲液pH根据样品选择。点样有干点法和湿点法。电泳后烘干、显色，定量可用洗脱法或光密度法。醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质，具有吸附少、无拖尾、快速、灵敏度高、应用广等优点，已广泛用于血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白等检测，为心血管疾病、肝硬化及癌症鉴别诊断提供依据。

6. 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从琼脂中提纯的线性多糖，通过氢键形成交联结构。凝胶孔径可通过浓度控制（常用1%-3%）。琼脂糖凝胶表面可能带电荷引起电渗，市售产品有不同提纯等级。适用于蛋白质和核酸电泳，尤其适合核酸提纯分析。对于DNA，迁移率主要与分子大小有关。低熔点琼脂糖（62-65℃）可用于样品回收。琼脂糖凝胶通常制成水平板状，用于等电聚焦、免疫电泳及DNA/RNA分析。

7. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

PAGE以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在自由基催化下聚合而成。孔径可通过单体浓度T和交联度C控制（T 3%-30%）。未加SDS的天然PAGE可保持生物大分子天然构象和活性，用于鉴定。PAGE优点：可控制孔径、结合分子筛和电荷效应、灵敏度高（10^-9~10^-12 mol/L）、化学惰性好、重复性好、透明度好、机械强度好、无紫外吸收。PAGE最初在玻璃管中进行（柱状电泳），后发展出垂直平板电泳（可同时分析多个样品）和水平平板电泳（冷却好、速度快、可用半干技术）。

8. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE是最常用的蛋白质定性分析方法，用于纯度检测和分子量测定。SDS（十二烷基磺酸钠）是阴离子去污剂，可破坏蛋白质二级和三级结构；β-巯基乙醇可断开二硫键。SDS与蛋白质结合后使复合物带大量负电荷，掩盖蛋白质本身电荷差异。样品处理液含SDS、β-巯基乙醇、溴酚蓝和蔗糖/甘油。制备凝胶时先选择分离胶浓度（如15%胶分离范围10^4-10^5），再铺浓缩胶（pH 6.8，浓度3-5%）。电泳采用不连续系统（Ornstein-Davis系统），浓缩胶中Cl-为快离子，甘氨酸为慢离子，蛋白质在界面处被浓缩。进入分离胶后，pH升高使甘氨酸电离度增大，迁移速度超过蛋白质-SDS复合物，蛋白质按分子量大小分离。电泳后染色（如考马斯亮蓝）检测。通过标准蛋白绘制log Mr-迁移率曲线，可测定未知蛋白分子量。SDS-PAGE灵敏度高，样品量<1 μg，适用于纯度检测和亚基组成分析。

9. 梯度凝胶电泳

梯度凝胶电泳采用浓度梯度（如5%-25%）的聚丙烯酰胺凝胶，孔径从顶部到底部逐渐减小。优点：分离范围宽（如4%-30%梯度胶可分离5万-200万分子量蛋白质）、分辨率高（可分辨分子量差异小的蛋白质）、可直接测定天然状态蛋白质分子量。适用于球蛋白分子量测定，但对纤维蛋白误差较大。电泳需较高电压（如0.5 mm厚平板胶用600V，50mA，约2小时）。

10. 等电聚焦

等电聚焦根据蛋白质等电点（pI）差异进行分离，分辨率可达0.01 pI单位。在凝胶中加入两性电解质形成pH梯度，蛋白质迁移至其pI处停止。两性电解质为多氨基-多羧基混合物，有不同pH范围。等电聚焦多采用水平平板电泳，常用薄层凝胶（0.15 mm厚）以降低成本。电泳后需用三氯乙酸浸泡除去两性电解质再染色。可用于测定未知蛋白质等电点，研究蛋白质微观不均一性（如磷酸化形式），分离同功酶。制备性等电聚焦可在梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶中进行。

11. 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）

2D-PAGE结合等电聚焦（第一维）和SDS-PAGE（第二维），是分离分析蛋白质最有效的手段。第一维在细管凝胶中进行等电聚焦，第二维将凝胶条置于SDS-PAGE浓缩胶上，蛋白质按分子量分离。细胞提取液可分辨1000-2000个蛋白质斑点，最高可达5000-10000个。可用于检测特定mRNA翻译产物等。目前已有计算机系统记录并比较二维电泳图谱。

12. 蛋白质的检测、鉴定及回收

常用染色剂：考马斯亮蓝R-250（灵敏度0.1 μg）、银染（灵敏度<1 ng，比考马斯亮蓝高100倍）、过碘酸-Schiff试剂（PAS，用于糖蛋白，灵敏度较低）。糖蛋白也可用凝集素检测。定量分析可用光密度扫描或切带溶解后分光光度法（半定量）。蛋白质回收常用电洗脱法，将切下的凝胶条装入透析袋电泳，使蛋白质进入缓冲液。

13. 蛋白质印迹（Western blotting）

印迹法将样品转移到固相载体（如硝酸纤维素膜）上，再通过特异性探针检测。Western blotting针对蛋白质，常用电泳印迹法（快速高效）。转移后封闭膜上剩余结合位点，用一抗（目标蛋白抗体）处理，再用标记二抗（如酶连抗体）检测。常用酶：碱性磷酸酶（底物BCIP生成蓝色产物）或辣根过氧化物酶（底物如鲁米诺化学发光）。其他标记方法：放射性标记、荧光标记、金标记、生物素-亲和素系统等。也可用放射性标记DNA探针检测DNA结合蛋白。

14. 毛细管电泳（CE）

CE又称高效毛细管电泳（HPCE），是20世纪80年代发展起来的快速分析方法。1981年Jorgenson和Lukacs首次在75 μm内径毛细管中用高电压分离。CE以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品组分淌度和分配行为差异实现分离。仪器包括高压电源、毛细管、检测器和缓冲液贮瓶。CE与HPLC相比：分析时间短（通常<30 min）、柱效高（理论塔板数可达百万）、样品量小（nL级）、流动相用量少（几毫升），但仅能微量制备。CE与普通电泳相比：分离速度快、检测器多样、定量精度高、自动化程度高。CE优点：高灵敏度（紫外检测限10^-13~10^-15 mol，激光诱导荧光达10^-19~10^-21 mol）、高分辨率（每米理论塔板数十万至千万）、高速度（最快60秒内完成）、样品少（nL级）、成本低。CE是发展最快的分离分析方法之一，尤其适用于生物大分子分离。