荧光原位杂交（FISH）和用引物介导的原位标记（PRINS）是细胞核DNA和RNA检测中的重要技术，广泛应用于遗传学、肿瘤学和临床诊断中。本文将详细介绍这两种技术的操作流程、所需仪器设备、试剂准备及关键步骤，旨在为科研和临床实验提供标准化操作指南，确保实验的准确性与重复性。
仪器设备
- 荧光显微镜（如奥林巴斯BX51）
- 数字显微相机（如奥林巴斯DP11）
- 微波炉
- 水浴锅
试剂准备
- 1×PBS缓冲液：由10×PBS稀释而成，储存于4℃
- 各种缓冲液（如20×SSC，pH7.0）及变性液，均应每次新鲜配制，确保质量
- 蛋白酶K消化液：浓度为25μg/mL，配制后在37℃水浴中预热
操作步骤
1. 脱蜡与预处理
首先用二甲苯进行三次脱蜡，每次5分钟；随后用100%酒精进行两次洗涤，每次2分钟，最后将切片斜置空气干燥备用。
2. 蛋白酶处理
用40ml蛋白酶K消化液在水浴中37℃孵育20分钟，之后用×SSC缓冲液在室温下洗涤三次，每次1分钟，接着进行梯度酒精脱水。
3. 核酸变性
用40ml变性液在78℃水浴中孵育8分钟，然后迅速转入-20℃预冷的70%、80%、90%和100%酒精中，每次2分钟，最后空气干燥。
4. 杂交
准备探针后，将10μl探针滴在切片上，盖上盖玻片，放入湿盒，在37℃孵育12-16小时。杂交后用43℃水洗，随后用2×SSC缓冲液在37℃洗涤两次，每次10分钟，最后用1×PBS缓冲液待检。
5. 免疫检测与信号放大
用30μl～60μl标记抗体（如罗丹明抗-地高辛抗体或FITC抗体）在室温孵育20分钟，洗净后用抗-卵白素抗体进行二次孵育，重复洗涤步骤。随后用DAPI染色核，观察细胞核位置。
PRINS技术操作
包括脱蜡、蛋白酶K消化、酒精脱水、PCR混合液加样、变性、杂交、洗涤、封片等步骤，详细操作流程确保DNA或RNA的特异性检测与信号增强。
这些技术的成功应用依赖于严格的操作规范和高质量的试剂，建议在操作前详细培训，确保每一步都符合标准流程，从而获得可靠的检测结果。