基因工程改造葡萄酒品质(3)
核心摘要:
疾病的控制通常是通过广泛使用杀真菌剂达到的。但是在全球许多地区,在生长季节多次使用杀真菌剂来控制真菌类病原微生物都导致形成抗药性的真菌种
疾病的控制通常是通过广泛使用杀真菌剂达到的。但是在全球许多地区,在生长季节多次使用杀真菌剂来控制真菌类病原微生物都导致形成抗药性的真菌种群,限制了使用喷剂控制疾病的效果。此外,不断增长的成本,对于环境的冲击以及公众对于在食品和饮品原料作物上使用杀虫剂的关注促使我们寻找其他疾病控制的替代方法。与传统的化学控制或者传统的害虫和疾病控制不同,前者的主要目标是消灭害虫和疾病,综合的害虫或者疾病管理的宗旨在于维持种群的平衡在耐受阈值之下,仅仅在种群密度超过某个行为阈值时才进行干预。同样的,葡萄具有个体发生上的抗性(通过发育依赖型方式获得,一般是组成型的而非诱导型),在果实形成后迅速获得对真菌的抗性,也标志着在有性生殖后葡萄发育阶段的开始,因此重新关注果实在高敏感性时期的疾病监控,将显著增强杀真菌剂使用的效率。
从葡萄酒中特异性移除蛋白质的技术困难要求我们寻求新的方法。可控替代的方法举例如下:
1.寻找能够水解葡萄中PR蛋白的外源性酶或者酶系。在这领域,目前有报道B.cinerea感染的V.vinifera的浆果果汁中表现为低的蛋白质水平,因为这一真菌中具有某些蛋白能表达蛋白水解酶的活性。
2. 在酿酒加工处理过程中精细的调整,能导致PR蛋白变性,使这些分子对于蛋白酶的活性变得敏感,例如,有报道短暂加热到90°C不会对白葡萄酒的感官特征产生负面影响。
3. 用酵母来源的甘露糖蛋白和其他的葡萄糖蛋白,命名为防混浊因子(胶状薄雾防护因子,HPF),表现出防治混浊的活性,不是通过阻止酒中的蛋白质发生聚集,而是通过降低混浊颗粒的尺寸大小,用肉眼可以勉强观察到。
4. 在葡萄藤表达外源性的,具有抗真菌特性的蛋白,但是必须同时对低pH值或者蛋白水解酶类敏感。
5. 寻找在葡萄内除了PR蛋白以外,其他在抗真菌中发挥作用的防御机制(例如,过表达植物抗毒素等)。除了PR蛋白,植物抗毒素防御机制,诸如二苯乙烯,是经常被观察到的其他主要的防御机制。其产量受到一个关键的酶——二苯乙烯合成酶的调控,后者产生葡萄中主要的植物抗毒素联苯酚。联苯酚随之被代谢为葡萄中其他主要的抗毒素。白藜芦醇(resveratrol)在抗真菌入侵中扮演了重要的角色,并对人体健康具有杰出的生物学效应。在应对多种真菌感染,紫外照射或者化学试剂处理时,它在葡萄叶和皮层中选择性的积累,根据葡萄栽培和酿酒工艺处理过程在葡萄酒中保持一定浓度。在生理浓度下,它具有显著的非特异性抗真菌的特性,能提高葡萄植株对B. cinerea,Plasmopara viticola以及Phomopsis viticola的抵抗能力。由于其抗氧化剂性质,白藜芦醇有利于葡萄酒的保存。这一植物抗毒素可以被认为是一种天然的杀真菌剂,具有内源性增强和外源性施用的应用潜力。目前大部分的注意力都集中在遗传工程修饰葡萄中的二苯乙烯合成酶基因,增加植物对病原微生物的抵抗力并且提高食品的营养价值。有报道基因重组了一个真菌诱导调控的启动子(一个紫花苜蓿PR-10启动子)和一个抗性基因(VST 1,葡萄二苯乙烯合成酶1的基因),介导入41B 根茎基因组((V. vinifera cv,Chasselas X,V.berlandieri)。一些转基因叶子在感染B. cinerea后,能积累比对照组高5~100倍的白藜芦醇,并表现出比较轻的症状。
6. 在葡萄中表达戒毒基因。Eutypine是由葡萄顶枯病真菌产生的一种毒素,是一个引发枝枯病相关症状的重要毒性因子。已经将名为Vr-ERE的基因克隆进入vigna.radiata,它能编码一个NADPH依赖的乙醛还原酶,对eutypine具有高度亲和力,能够将它还原成为eutypinol。由于eutypinol对葡萄组织没有毒性,这一解毒机制很可能在防御中发挥作用。在葡萄根茎中过表达Vr-ERE基因能增加植物抗毒的能力。确实,转基因植物的生长和发育不受毒素存在与否的影响,而对于那些没有转基因的植物则会受到毒素的高度抑制作用。
7. 开发新的杀真菌剂或者其他天然的化合物甚至微生物——必须是不威胁环境生态条件的。例如,内源性多聚半乳糖醛酸酶1,一种来源于B.cinerea的糖蛋白,以表现出能激活葡萄中的防御反应。类似的,适用细菌作为替代性的植物疾病监控中的杀真菌剂也具有巨大的潜力。选择性的使用有益细菌,如植物根圈促生细菌(PGRR),就能介导产生系统性抵抗由病毒、细菌、真菌甚至植食性害虫引发的一系列广谱疾病。一类促进植物生长的,生物及厌氧压力抗性的内共生细菌,非荧光假单胞菌中的PsJN菌株,被用于促进生长,有益于发育并且介导葡萄对于B.cinerea的抵抗力。
在未来的若干年内,全世界的研究人员们将集中关注目前在葡萄生产和酿酒中遇到的两个主要问题:控制真菌对于葡萄叶及浆果的危害,以及降低由于蛋白质造成葡萄酒中胶质薄雾的风险。现有的解决方案还是不全面的,对替代性方法的寻找和开发变得日益急迫。从理论的角度而言,两种问题都可以通过转基因葡萄的方法来解决。但是,这些技术的直接运用会导致生物技术的两难境地,换言之,通过过表达PR蛋白来提高葡萄抵抗真菌病原体的能力会伴随着在葡萄酒浊度上面临的风险,反过来通过抑制在葡萄中的表达试图将葡萄酒中的PR蛋白移除的方法又增加了植物对于寄生物的易感性。