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流式细胞仪实验方法(7)

时间:2005-04-05 13:16来源:本站原创 作者:bioguider 阅读:

固定通透的细胞离心500g

固定后细胞密度低于活细胞,需用高转速离心。

加样步骤丢失细胞

弃上清带走细胞

小心吸样

溶血不完全

PMA+Ionomycin激活

按操作步骤用FL3做阈值去除碎片和未溶细胞

PMA可稳定红细胞膜,PMA+I激活全血较难溶

溶血未在室温进行

在室温进行溶血

 

  


Th1/Th2细胞研究方法
尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志,但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段,特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现,为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现,在外周血白细胞中,除CD4淋巴细胞外,CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化,甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力,如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。
根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答;而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子,促进抗体的产生,介导体液免疫反应。在多数免疫反应中,T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子,而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下,Th0细胞受特异抗原的刺激时,一方面向Th1方向发展,另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应,在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现,Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程,如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等,而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足,通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3+/CD4+  或CD3+/CD8-作表面标记,选择相应的荧光标的抗体,Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如下: 
 
全血标本经过刺激培养、表面标记、固定、破膜、胞内染色(IQ,Cytodetect™kit(basic),CAT方法,IQP-367)后结果如下:

正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值
一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后,按照操作程序测得参考值如下:
 

(责任编辑:泉水)

细胞因子

阳性细胞(均数%

阳性细胞(范围 %

IL-2

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