随着美国和欧洲逐渐减少动物实验研究，类器官已被广泛推崇为研究人类大脑的一种极具前景的替代方法。自2013年人类大脑类器官首次亮相以来，该领域取得了显著进展。目前，研究人员已能够利用干细胞诱导并整合多种细胞类型，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和中间神经元。他们甚至可以将特定脑区的类器官融合成被称为“类器官组装体（assembloids）”的结构，该结构与大脑内部的神经网络高度相似。
然而，乌特勒支大学医学中心的博士后研究员 Christiaan Huffels 指出，现实中这些细胞团块仍存在“重大缺点”。这些缺陷包括缺乏血管化，这限制了细胞的生长与存活，并会阻碍组织的成熟。“如果我们审视目前使用的类器官中神经元的电生理特征，我认为其电生理表型大体上仍处于早熟或未成熟的阶段，”Huffels 说道。
宾夕法尼亚大学神经科学教授 Hongjun Song 指出，类器官同时缺乏人类大脑中特有的细胞微细结构（cytoarchitecture）。此外还存在高异质性的问题：每个实验室都有自己的一套类器官培养方案，因此很难在不同实验室之间甚至同一实验室内部实现标准化以获得可重复的类器官。
为了克服这些瓶颈，神经科学家正在利用各种策略来构建更复杂、生物学上更精准、可重复性更高且更能代表人类后期发育阶段的类器官。Song 表示：“当前的下一个前沿是超越通用的细胞类型，探索其他生物学特性。例如，我们现在能否研究神经网络的形成？虽然我们还没有完全达到这一目标，但已经有了研究下一步的重要方法论。”
西南国家灵长类动物研究中心主任 Corinna Ross 认为，这些改进对于类器官最终取代动物研究至关重要。不过，这一时刻尚未到来。“坦率地说，垃圾进，垃圾出。如果类器官和科学技术尚未准备好，那么你所提出的问题就无法得到解答。”
攻克血管化与缺氧难题
类器官需要克服的主要限制之一便是缺乏血管系统——尽管研究人员目前正致力于部署各种替代解决方案。当类器官从微小的细胞球膨胀到大约5毫米的豌豆大小的球体时，结构深处的细胞便无法从外部获取营养。由于没有功能性血管，外部分子只能扩散有限的距离。结果导致最中心的细胞无法获得充足的营养和氧气并最终死亡，留下一个可能使其余细胞发育偏离正常轨道的坏死核心。
加州大学圣迭戈分校儿科学及细胞与分子医学教授 Alysson Muotri 指出，血液供应不仅能帮助细胞存活，还决定着正常的发育进程。“血管化是人类大脑形成所固有的本质。”
神经胶质生物学教授 Hol 表示，在脑类器官中添加内皮细胞或将其与血管类器官结合，有助于将血液和营养物质输送到更多的细胞中。研究表明，应用或过表达血管生成生长因子可进一步增强培养物中的血管化。这些策略赋予了整个类器官类似血管的结构，并表达与血脑屏障相关的连接蛋白。
神经工程学同样发挥了关键作用。例如，研究人员可以在模拟血管网络的支架上或通过3D打印血管来培养脑类器官，以分发营养物质。研究显示，采用工程化血管培养的类器官表现出更好的增殖能力和神经分化水平。
在生长几个月后将类器官切片，则是另一种替代策略：它使内部细胞能够直接接触氧气和营养物质，从而绕过了对血管化的需求。气液界面（air-liquid-interface）类器官的切片顶部暴露于空气中，而切片底部与培养基保持接触，其存活时间可以比完整的类器官维持数月之久，且能发育出功能性的轴突束。Song 的研究工作表明，使用切片甚至可以让类器官的细胞增殖并形成扩展的皮质板。
Hol 认为，这些策略可能有助于保护脑类器官免受缺氧和坏死的侵害，但它们终究不是真正血管化类器官的优化方案。“我们的确把内皮细胞引入了进去，有时也能得到看起来像血管的结构，但它们并不是真正具功能的血管。”
加速老化与长期培养的突破
Huffels 指出，这反过来限制了类器官发育的健康程度。研究通常使用培养3到4个月的类器官，这大致相当于人类妊娠中期胎儿的大脑，且处于坏死现象发生之前。Song 表示，这为研究发育提供了一个关键窗口期，但在如何利用类器官研究更成熟的大脑及神经退行性病变等过程时，研究人员受到了限制。
加速脑类器官成熟的方法之一是将它们移植到啮齿类动物的大脑中，这可以提供一个支持性的微环境——包括一个功能性的血管系统。研究表明，移植到啮齿类动物皮层中的类器官能够融入宿主大脑，并比体外培养的同类展现出更复杂的形态。
将类器官送入太空也能使其更快老化。Muotri 的研究显示，在国际空间站轨道上培养一个月的类器官，与在地球上培养的相比，表现出更多与神经元成熟相关的基因。Muotri 未发表的研究还发现，太空中的类器官会积累衰老特征。Muotri 称，这30天代表了地球上的10年时间。“我们在几周内压缩了它们的胚胎发育时间。”
近期的一项实验方案表明，微调培养条件（例如保持培养皿中的低类器官密度并更频繁地更换培养基），可以改善氧气和营养物质的可用性，最大程度减少坏死核心的形成并延长类器官的保存时间。
哈佛大学干细胞与再生生物学教授 Paola Arlotta 指出：“要探讨我们是否能够达到生命后期的成熟阶段，我们需要将这些类器官培养很长一段时间。”她的研究发现，类器官与人脑同步老化，最长可达7年。由于部分得益于一种活性促进培养基（APM），这些老化的类器官获得了适当的细胞类型组合和表观遗传特征，表明它们确实在以类似于出生后人脑的方式成熟。
Arlotta 补充道，尽管这些类器官仍存在坏死核心，但在 APM 培养条件下，缺氧和细胞凋亡的特征已显著减弱。要彻底消除坏死核心，“极有可能需要开发能够将培养基灌注到类器官中心的系统”。
朝向正确的细胞架构迈进
Song 表示，所有这些努力的终极目标是创造出具有正确细胞架构的类器官：即在正确的时间、正确的地点将正确的细胞类型与适当的区域连接起来。为此，研究人员在创建包含所有六大主要脑细胞类型（神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞和内皮细胞）的类器官方面取得了进展，并且能够培育出类似于特定人类大脑区域的类器官，包括模拟杏仁核细胞组成、发育及其他特征的端脑类器官。
研究人员试图重现人脑中观察到的连接的方法之一，是开发特定区域的类器官并将它们融合成类器官组装体（assembloids），这一方法由斯坦福大学的研究人员率先开创。去年，他们生成了体感、背侧脊髓、丘脑和大脑皮层类器官，重现了痛觉通路的连接，并证明这些四部分组成的组装体能够对有害刺激做出反应。最近，该团队将包含5-羟色胺能神经元的中脑-后脑类器官与人类皮质类器官相融合，以研究神经调控系统。
然而，这些类器官面临的一个挑战是，其组成细胞的发育可能与真实大脑的步调不一致。根据一项新研究显示，例如，放射状胶质细胞产生神经元的速度比小鼠体内的大脑要早。Song（未参与该项工作）指出，这些差异部分归因于类器官缺乏人脑在发育过程中表现出的适时信号。在正常发育过程中，连接是通过形态发生素（morphogens）的动态且可靠的交响乐般的作用产生的，而这些信号在类器官培养中是缺失的。
Muotri 坦言：“我们的模型中缺失了许多正在进行沟通的关键信号。”
促进类器官产生自身分泌形态发生素的中心，或使用水凝胶等平台，旨在更好地模拟正常发育。然而，Song 指出，这些方法通常会向类器官均匀地提供形态发生素。相比之下，微流控设备能够以时空精度提供信号梯度——2024年的一项研究表明，这已使得研究人员成功创建了类似神经管的结构。
即便拥有如此高的精度，类器官仍表现出高度的异质性。Muotri 补充说，使用相同的细胞系采用相同的方案，仍然可能导致异质性类器官的产生。“正如我把一个蛋糕的食谱给两三个人，每个人做出来的蛋糕都会不同一样，类器官的配方也是如此：同样的操作在不同人手里——甚至在我自己的实验室里——都会产生巨大的变异性。”
Hol 认为，从积极的角度来看，这种类器官的多样性恰好反映了人类的变异性。但 Song 指出，过多的变异性也阻碍了研究人员的进展，因此该领域需要致力于标准化培养方案，以获得不同实验室间可重复的类器官——例如通过使用工程学方法（如支架）来培养出大小、架构和组成完全相同的类器官。
对包括 Muotri 在内的一些研究人员而言，类器官是最终消除动物研究的踏脚石。“全面替代应该成为主要目标，”他说。
但是，类器官的改进是否能够达到这一目标？Song 认为：“这一切都取决于研究的问题。”例如，对于检查肿瘤生物学的研究，这是可能的；而对于其他研究（如观察回路水平功能的研究），即使该领域解决了所有问题，“我们仍然两者都需要。”