简介

本文介绍了一种利用T7、T3或SP6 RNA聚合酶进行大规模合成合成RNA的方法，适用于科研中需要大量RNA产物的场景。该方法包括模板制备、转录反应、纯化及相关试剂准备，具有操作简便、效率高的特点，广泛应用于基因表达研究、RNA结构分析及疫苗开发等领域。

操作流程

一、模板制备与RNA转录

可以使用PCR扩增的模板或经过2倍铯离子梯度纯化的质粒DNA，插入片段长度从200 bp起。常用的质粒载体如pBluescript含有T7/T3启动子序列，pSP64和pSP65含有SP6和T7启动子（Melton等，1984）。

替代纯化方法包括使用Eppendorf Perfectprep质粒纯化试剂盒： - 按照碱性质粒提取步骤，从50 ml培养物中制备，重悬于300 μl TE缓冲液。 - 加入300 μl冰冷的5M LiCl，充分混匀，4°C离心10秒（沉淀部分RNA）。 - 转移上清至新管，加入600 μl异丙醇，充分混匀，室温离心5秒。 - 去除上清，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后重悬于250 μl含有20 μg/ml RNA酶A的TE缓冲液中，室温孵育30秒。 - 加入250 μl含有13% PEG 8000的1.6 M NaCl，充分混匀，4°C离心5秒。 - 去除上清，用200 μl TE重悬沉淀，进行酚-氯仿提取，最后用RNA酶自由的乙醇沉淀，干燥后重悬于100 μlRNA酶自由的TE缓冲液中，检测浓度和完整性。

二、模板线性化与转录反应

- 将25 μg模板DNA用酶在其下游切割，确保酶留下平末端或5'突出端，避免非特异性启动。酶切后用蛋白酶K处理30秒，进行酚-氯仿提取，沉淀后重悬于25 μl TE中（pH 8.0）。

- 转录反应：在室温下按顺序加入以下试剂：

• 7 μl DEPC水
• 4 μl 5X缓冲液
• 2 μl 0.1 M DTT
• 1 μl 10 mM UTP
• 1 μl 10 mM ATP
• 1 μl 10 mM CTP
• 1 μl 10 mM甲基-GTP
• 1 μl 2.5 mM GTP
• 1 μl 1 mg/ml限制性DNA模板
• 0.5 μl RNA酶抑制剂（40 U/μl）
• 0.5 μl RNA聚合酶（20 U/μl）

在37°C下孵育1小时，之后加入额外的RNA聚合酶继续孵育1小时。降低温度可提高完整转录产物的比例（Krieg和Melton，1984）。

三、模板DNA的酶解与纯化

- 加入1 μl RNA酶自由的DNase，在37°C孵育10秒，去除DNA模板。

- 体积调整至100 μl，使用酚-氯仿提取，沉淀后用NaOAc和乙醇沉淀，最后用RNA酶自由的水重悬，经过RNA纯化柱纯化后获得纯净RNA。

四、注意事项与试剂准备

- 所有试剂和操作容器应确保无RNA酶污染，使用RNA酶自由的试剂和耗材。

- 试剂包括T7/T3/SP6转录试剂盒、NTPs、DTT、甲基-GTP、RNA酶抑制剂、酚、氯仿、RNA纯化柱等，确保质量可靠以获得高产率的RNA产物。

五、技巧提示

- 降低反应温度有助于获得较长的RNA产物（Krieg和Melton，1984）。

- 纯化步骤中的酚-氯仿提取和沉淀是确保RNA纯度的关键环节，应严格操作。

通过以上步骤，可以高效制备大量高纯度的RNA，满足科研和临床研究的多种需求。