SCCA1和SCCA2的夹心ELISA检测方法

实验步骤

1. 将亲和纯化的兔抗SCCA抗体用PBS稀释1:400（每次亲和纯化后需要确定合适的稀释倍数）。将100μl稀释后的抗体加入96孔ELISA板的每个孔中（使用Becton Dickinson公司的Probind板）。室温孵育1小时。

2. 用PBS/0.1% Tween洗板3次。用PBS/0.1% Tween/1% BSA在室温下孵育1小时，以“封闭”非特异性蛋白吸附。

3. 在封闭液中按1:4比例连续稀释GST/SCCA1或GST/SCCA2，浓度梯度为200、50、12.5、3.12、0.78 ng/ml。在Eppendorf管中准备稀释液，然后将100μl/孔（或50μl，如果样本量有限）一式两份转移到板上。室温孵育1小时。

4. 用PBS/0.1% Tween洗板3次。

5. 将小鼠单克隆抗体8H11（抗SCCA1单抗，小鼠腹水）稀释1:4000或10C12（抗SCCA2）稀释1:1000于封闭液中。加入100μl到每个孔中，室温孵育1小时。

6. 用PBS/0.1% Tween洗板3次。

7. 将HRP标记的山羊抗小鼠IgG按适当稀释倍数稀释于封闭液中。加入100μl到每个孔中，室温孵育1小时。

8. 用PBS/0.1% Tween洗板3次。

9. 将1片OPD底物溶解于5ml OPD稀释液（Abbott）中。加入50μl到每个孔中。孵育直到标准品显色，并在“零”抗原孔出现颜色变化前，用250μl/孔的1.25 M H2SO4终止反应。

10. 在492 nm波长下读取吸光度。使用Softmax软件程序（Molecular Devices）通过四参数方程绘制SCCA1/SCCA2浓度与492 nm吸光度的关系曲线。