Toll样受体4（TLR4）及其相关的MD-2在髓系细胞对LPS的反应中发挥作用。虽然目前尚未明确其确切机制，但已有研究报道，TLR4抗体能够抑制人外周血单核细胞（PBMCs）和小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的细胞因子产生。我们对参考文献中发表的阻断实验进行了微调，使用单克隆抗体HTA125（抗人TLR4）和MTS510（抗小鼠TLR4/MD2）。本方案提供了一个通用指南，研究人员应在自己的实验系统中优化不同的实验条件，包括细胞类型和数量、抗体浓度、适当的刺激类型和孵育时间。
实验步骤：
1. 制备人PBMCs，将1ml浓度为2x106/ml的细胞悬液分装到24孔培养板的每个孔中。
2. 用20μg/ml的HTA125或同型对照抗体预孵育细胞。
3. 在37℃下孵育0.5-1小时。
4. 添加浓度为10ng/ml的LPS。
5. 在37℃、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞16-24小时。
6. 从每个孔中收集1ml培养上清，500×g离心，收集上清液并丢弃细胞沉淀。
7. 按照人IL-6或TNF-α Ready-SET-Go ELISA试剂盒的说明书进行后续操作。
所需材料：
人PBMC悬液
培养基（RPMI，含10% FBS）
24孔平底培养板（Costar，目录号3526）
功能级（FG）抗人TLR4，克隆HTA125（目录号16-9917）
功能级（FG）小鼠IgG2a同型对照（目录号16-4724）
脂多糖（LPS）（Sigma，目录号L-8274）
eBioscience人IL-6 Ready-SET-Go ELISA试剂盒（目录号88-7066）或eBioscience人TNF-α Ready-SET-Go ELISA试剂盒（目录号88-7346）