日前，第四军医大学西京医院全军骨科研究所联合整形外科、肿瘤科专家，在国家自然科学基金资助下，成功应用人工TATA盒（基本转录因子TFIID结合位点，位于转录起始点上游-25~-30bp，控制转录起始的准确性及频率）对人端粒酶逆转录酶亚基（hTERT）核心启动子进行修饰，并利用其构建小发卡状RNA（shRNA）表达载体，进而实现肿瘤特异性RNA干扰（RNAi）。该研究为提升基于RNAi技术的基因治疗安全性奠定了基础。

已有研究表明，在85%以上的人类肿瘤细胞中存在端粒酶的再激活。作为肿瘤特异性启动子，hTERT已被广泛用于靶向转录基因治疗研究。RNA干扰是指双链RNA（dsRNA）介导的同源mRNA高效降解现象，普遍存在于植物、真菌、线虫、果蝇和哺乳动物中，并在进化中高度保守。目前，RNAi已成为筛选新基因、探索基因功能和寻找有效药物靶点的重要工具。

为修饰hTERT核心启动子、构建shRNA表达载体并实现肿瘤特异性RNA干扰，西京医院研究人员使用人工TATA盒修饰hTERT核心启动子，重建转录起点；将含有修饰后hTERT启动子的MluI/XhoI片段克隆至pGL3-OCP-shLuc的相应酶切位点，获得pGL3-mhTERT-shLuc；设计针对p53的shRNA编码序列，并通过将XhoI/XbaI克隆至pGL3-mhTERT-shLuc的相应酶切位点之间，获得pGL3-mhTERT-shp53；利用pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-control共转染人骨肉瘤细胞U2OS、MG-63和HOS，并以共转染1μg pGL3-control和1μg pGL3-mhTERT作为对照组，48小时后测定荧光素酶活性并计算相对活性；利用Western Blot法分析转染前后p53的表达水平。

该研究获得三项重要成果：经双酶切鉴定和DNA测序证实，pGL3-mhTERT-shLuc和pGL3-mhTERT-shp53的序列与研究设计完全一致；pGL3-mhTERT-shLuc与pGL3-control共转染实验发现，hTERT阴性的U2OS细胞荧光素酶相对活性与对照组相比无明显差异，而hTERT阳性的MG-63和HOS细胞在转染后荧光素酶相对活性显著降低，与对照组相比抑制效率分别达到69.7%和71.0%；Western Blot分析表明，与转染pGL3-mhTERT相比，使用pGL3-mhTERT-shp53转染MG-63和HOS后，可显著抑制p53表达，而U2OS的p53表达水平与对照组无明显改变。

据研究人员介绍，由于hTERT启动子是公认的肿瘤特异性启动子，且hTERT高表达于多种类型肿瘤细胞和瘢痕组织中的成纤维细胞中，该启动子经修饰后不仅可用于乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤等多种类型肿瘤的靶向基因治疗，还可用于靶向杀伤瘢痕组织中的成纤维细胞，从而达到安全、有效治疗肿瘤和瘢痕的目的。上述研究通过对hTERT核心启动子进行修饰并构建shRNA表达载体，成功实现肿瘤特异性RNAi干扰，大大提高了基于RNAi的基因治疗策略的安全性。