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<<实验动物学>>(6)

时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 阅读:

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    三、繁殖
    封闭群一般采用随机交配繁殖,就是在一群繁殖的动物中,每个个体都有同样的机会同另一性别中的任何一个个体进行交配并繁殖。因此,这种交配方法既不管其亲代来源,也不考虑它们的亲缘关系,所以是随机的。其目的是防止近亲繁殖,而不使后代中分离出独立的品系。
    目前国内外对封闭群动物的管理规定尚不统一,1963年和64年ICLAS 曾提出“不从外面引种的群体为封闭群。”但是这一规定还仅仅最基本的,实际上尚应包括群体封闭年限、群体的大小和繁殖结构。ICLAS 1987年进一步规定,以非近亲交配繁殖的一个动物种群,在不从外部引进新的血缘条件下,至少连续繁殖4代以上称封闭群。
    1973年日本实验动物研究会规定:“5年以上不从外部引种,只在一定的群体中进行繁殖,为经常提供实验动物而进行生产的群体叫做封闭群”。
    把小鼠封闭群的封闭饲养时间定为5年, 原因是假设从两个近交系开始培育一个新群体(杂交群),在F1代中存在的杂合基因,最初随繁殖代数的变化而其基因型出现的频率也不断变化。直到15代以后,才趋于稳定。正常繁殖的小鼠,大约每年繁殖3代。达到15代,约需5年时间。
    中国国家卫生部1992年《医学实验动物标准》(见本书附录二)对封闭群动物的定义和繁殖方法作了较为详尽的规定,是参照执行的最好方法。
    随机繁殖可维护遗传变异性,它的基因型是杂合的,因而没有近亲衰退现象。每代双亲的数目越大,则随机交配对的平均亲缘关系越远。因此为了减少近亲繁殖到一个最小限度,则远交群必须保持在最大可能饲养的双亲数量。如果一个原种要无限地维持下去,则近亲率的目标应订在每代不得越过1%。根据近亲的理论推算,采用随机交配,将需要使用25对双亲所生下的子代。在实践中,原种的遗传性质亦依赖于自然和人工两者选择的结果。如果把产仔数较少的交配对淘汰,这种选择将迫使赢得较高的生产能力,并将有助于抵销因近亲繁殖对生产力的影响。
    四、应用
    远交群动物的遗传组成具有很高的杂合性,因此在遗传中可作为选择实验的基础群体,用于对某些性状遗传力的研究。同时远交群可携带大量的隐性有害突变基因,可用于估计群体对自发或诱发突变的遗传负荷能力。远交群具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成,因此在人类遗传研究、药物筛选和毒性试验等方面起着不可替代的作用。远交群具有较强的繁殖力和生活力,表现为每胎产仔多、胎间隔短、仔鼠死亡率低、生长快、成熟早、对疾病抵抗力强、寿命长,加之饲养繁殖时无需详细记录谱系,容易生产,成本低,可大量供应,因而广泛应用于预试验、教学和一般实验中。突变种所携带的突变基因通常导致动物在某些方面的异常,从而可成为生理学、胚胎学和医学研究的模型。

              第六节  突变系动物

    一、基本概念
    突变系动物是带有突变基因的品系动物。人们把具有突变基因的动物称为突变动物,将这些突变动物按照科学研究的要求进行定向培育,使育成的动物符合实验要求,称其为“突变系”动物。
    二、繁殖
    (一)培育纯合子型的突变系:连续选择携带目的突变基因同时有繁殖能力的兄妹进行交配,使其子代基因纯合,经过20代即可育成。
    1. 单一隐性
    啮齿动物中大多数常见毛色的基因属于这种类型。纯合的单一隐性基因虽然是反常,但能良好的生活和繁殖。以白化(c)为例,简单的繁殖方法是白化之间的交配,就能生产全部白化的后代。
                  cc×cc→全部cc(白化)
    有时为了保持动物健壮,需要与其它品系进行异型杂交。如果另一品系是正常的毛色基因型,异型杂交所产生的全部杂合子,其表现型是正常的。
                  cc×++→全部c+(正常)
    再把杂合子(c+)互相交配,可以预期得到1/4白化和3/4正常型。
       c+×c+→1/4cc(白化); 1/2c+(正常); 1/4++(正常)
    然后再用白化与白化交配,可以生产出全部白化动物。采用白化与杂合(c+)回交,可以产生半数白化和半数正常的动物。
            c+×cc→1/2cc(白化):1/2c+(正常)
    回交具有许多优点,它产生的子代具有数量相等的双亲基因型,因此可以世世代代地重复交配繁殖。另外,它生产的子代是一半正常一半反常的,所以当研究需要正常的同一胎子代作为对照时,那么这种交配方法最为适用。
    2. 显性
    繁殖显性突变原种,最常用的交配方法是采用杂合子突变与正常动物交配。这个结果能生产相同数量的突变型和正常的子代。以小鼠短卷毛为例。
      Re+(短卷毛)×++(正常)→1/2Re+(短卷毛):1/2++(正常)
    如果是杂合子之间的交配,则将能生产3只突变型和1只正常。
      Re+×Re+→1/4ReRe(短卷毛):1/2Re+(短卷毛):1/4++(正常)
    (二)培育杂合型的突变系:当突变基因的两性中的一性或两性不能繁殖时,多采用育成杂合型的近交系,以保持其突变基因不被丢失。
    1. 隐性纯合中的一性是不良的繁殖者
    有的突变型缺陷严重地危害纯合子动物的生理功能,而使其丧失繁殖能力。例如小鼠隐性“无毛”(hr),因为纯合子(hr hr)母鼠不能哺育乳鼠,所以不能用纯合子之间的交配。但因无毛雄鼠能繁殖,因而采用无毛雄鼠与杂合(+hr)雌鼠回交的繁殖方法。
            hr hr♂×+hr♀→1/2hr hr:1/2+hr.
    又如裸鼠(nu/nu),它繁殖困难,生产能力极低,因而限制了使用范围。约2/3的纯合裸雄鼠不育和所有纯合裸雌鼠不哺育仔鼠。因此在这种情况下,只有使用杂合子与纯合子之间交配繁殖。
            nu nu♂×+nu♀→1/2nu nu:1/2+nu.
    有人报导使用1只纯合雄鼠(nu/nu♂)配3只杂合雌鼠(nu/+♀),结果平均每月每笼离乳的裸鼠为8.5只,占整个离乳幼鼠的43%。
    2. 隐性纯合中的两性都不能繁殖
    如果隐性纯合的两性都不能繁殖,则饲养繁殖该基因型的原种就较为困难。小鼠垂体性侏儒(dw)基因就是一个例子,纯合子侏儒(dw/dw) 缺乏垂体生长激素并且两性都不育。假如采用杂合子之间的交配,即能生产1/4侏儒和3/4正常的子代。
        +dw×+dw→1/4dw dw (侏儒):1/2+dw(正常):1/4++(正常)
    表现型正常的动物中有2/3是杂合子(+dw),适用于繁殖侏儒鼠,但是在外貌上无法与正常纯合子(++)相区别,所以外观正常的动物用“+dw?”标记。 测试外貌正常的基因型要经过试验。其方法有二:
    (1)取1只+dw?与另一只已知的杂合子(+dw)交配,如其子代产生1/4侏儒仔,则可证明此待查+dw?动物是+dw;如这种试交的结果,子代中没有侏儒仔,则该动物则是++。
    (2)把未知的子代互相随机交配。表现型正常的动物有2/3机会是杂合子(+dw)。这样合在一起将有2/3×2/3=4/9的机会是预期的基因型。因此,可以平均接近 1/2产生侏儒仔。  如果交配结果不产生侏儒仔,  则必然是这一对中有一只或二只是正常的纯合子(++)。
三、应用 
    现在已经发现的小鼠突变基因有648个,家兔有76个,大鼠有105个和豚鼠有38个。这些突变型动物,有的已应用在科学研究中,特别是那些与人类某种疾病相类似的突变型动物已用做动物模型进行研究。有与人类疾病相似的肥胖症和糖尿病小鼠、肌肉萎缩症(dy)小鼠、溶血性贫血(ha)小鼠等。广泛使用的无胸腺裸鼠,由于它缺乏胸腺, 因此是免疫学研究的重要动物模型。裸鼠能接受多种人类癌细胞的移植,并已成为癌症机理的研究和治疗癌症药物筛选的良好动物模型。裸鼠还能感染麻风杆菌,这对研究麻风的发病机理和制造麻风菌苗提供了动物模型。

               第七节  裸鼠

    T淋巴细胞功能缺陷的动物有裸小鼠(基因符号nu)和裸大鼠(基因符号rnu)利用育种技术已将裸基因nu或rnu导入其它品系动物,作为背景品系可以是近交系也可以是封闭群,目前nu基因已导入的近交系有数个以上。rnu基因导入的大鼠品系也有10余种。 我国使用较多的裸鼠品系BALB/c-nu、NC-nu、Swiss-nu、NIH-nu。1980年和1982年中国药品生物制品检定所分别从瑞士和日本引进裸小鼠,上海中山医院肝癌研究所1983年从美国引进了裸大鼠Rowett。
    一、裸小鼠
    (一)概念及命名:1962年英国格拉斯医院Grist 在非近交的小鼠中偶然发现有个别无毛小鼠, 后来证实是由于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良,称为裸小鼠(nude mice),用“nu”表示裸基因符号。裸小鼠是由于染色体上等位基因(第11对染色体上)突变引起的,已失去正常胸腺, 原胸腺残留结构部分上皮样细胞呈巢状排列而部分呈外分泌腺结构。裸鼠淋巴结胸腺依赖区的淋巴细胞消失,外周血中淋巴细胞数目减少。1969年丹麦Rygaard首先将人类结肠腺癌移植裸小鼠成功,为免疫缺陷动物研究和应用开创了新局面。
    (二)特性:裸小鼠的主要特征表现为无毛(hair less)和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺,仅有胸腺残迹或异常上皮,这种上皮不能使T细胞正常分化,缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能,因而细胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴细胞正常,但功能欠正常,免疫球蛋白主要是IgM,只含少量IgG。裸鼠由于T淋巴细胞缺陷,不能执行正常T淋巴细胞功能,在混合淋巴细胞反应中全无有丝分裂反应,也不产生细胞毒效应细胞,对刀豆A或植物凝集素亦无有丝分裂应答,无接触敏感性,无移植排斥,成年裸小鼠(6-8周龄)较普通鼠有较高水平的NK细胞活性,但幼鼠(3-4周龄)的NK细胞活性低下。裸小鼠粒细胞比普通小鼠数量少。由于背景品系不同,不同品系的裸鼠往往具有不同的生物学特征。必须指出,随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸鼠体内正常T细胞会增加,故接种肿瘤实验一般采用4 ̄8周小鼠。
    (三)繁殖:裸小鼠抵抗力差,易患病毒性肝炎和肺炎,因而饲养和繁殖要求条件比较严格,在SPF环境下可生存,所用的笼具、垫料、饲料、 饮水等都要求经过严密灭菌消毒并采用隔离器饲养,以保证长期存活并进行繁殖。由于纯合型雌裸小鼠nu/nu 受孕率低,乳腺发育不良且有食仔的习惯,因此生产上一般采用纯合型雄鼠与杂合型雌鼠交配(♂nu/nu×♀nu/+)可获1/2纯合型仔代。
    二、裸大鼠
    (一)概念及命名:裸大鼠由英国Rowett研究所在1953年发现,基因符号为rnu, 属染色体隐性遗传。裸大鼠免疫器官的组织学与裸小鼠极为相似。3 周龄裸大鼠纵膈的连续切片中,只见胸腺残体,未见淋巴细胞,淋巴结副皮质区实际上无淋巴细胞。T 细胞功能丧失。
    (二)特征:裸大鼠的一般特征似裸小鼠,但躯干部仍有稀少被毛并非象裸小鼠那样完全无毛,头部及四肢毛更多,繁殖方法与裸小鼠相同。裸大鼠易患呼吸道疾病( 溃疡性气管支气管炎及化脓性支气管肺炎,病因可能与仙台病毒感染有关)。 裸大鼠的发现及人癌异种移植成功,给肿瘤免疫研究增添一个新的手段。以裸大鼠代替裸小鼠,具有移植肿瘤大,取血量多,可行某些外科小手术等优点。因此比裸小鼠有一定优越性,其缺点是维持经费比裸SPF小鼠更高。
三、应用
    1. 裸鼠在肿瘤学方面的应用  有人分析了381例肿瘤的裸鼠移植规律,发现人癌手术标本裸鼠异种移植成功率是28.3%,其中复发性肿瘤移植成功率为50%,转移性肿瘤为38.5%均高于原发瘤的移植成功率20.5%,大约1/3 的人癌组织在裸鼠中可持续性生长建立人肿瘤瘤株。当肿瘤传到第三代后,90%的移植瘤株可成为肿瘤细胞系。 人癌组织异种移植,以恶性黑色素瘤和结肠癌的成功率最高,乳腺和淋巴网状内皮细胞肿瘤成功率低。移植后,肿瘤生长速度也不一样,女性生殖系统肿瘤和结肠癌生长最快,胚胎性和骨的肿瘤生长很慢,转移和复发肿瘤在裸鼠中生长比原发部位肿瘤更快。以后肿瘤传代时间短于原代移植生长时间。人癌组织裸鼠移植,分化低的肿瘤易建立成肿瘤细胞系,传代时生长更快。
    一般说来,用已建株的癌细胞系移植裸鼠移植成功率高于用人癌手术标本移植。美国国家癌瘤研究所Gazdar分析人类肺癌移植于裸鼠120例,已在体外建立的肺癌细胞系的移植成功率高达90%,而新鲜肺癌实体瘤的裸鼠移植成功率只有40%。人类肿瘤(癌组织块和成株的细胞系)的裸鼠移植可以建立裸鼠移植瘤,从而开展肿瘤基础和临床研究的各种重要课题。
    人类肿瘤移植裸鼠体内能够成功,动物的肿瘤无论同种或异种移植至裸鼠体内也能成活和传代,如分泌生长激素的鼠垂体肿瘤细胞培养后接种至裸鼠体内成瘤,并且引起被接种的裸鼠出现了持续体重增加,鼠的血容量和主要器官体积也成比例增大。人的癌前病变和良性肿瘤很难作体外培养,把人的癌前病变和良性肿瘤移植于裸鼠的实验,目前只有少数报导。如粘膜白斑病人的口腔粘膜移植于裸鼠皮下,有60%能生长。人的良性结肠息肉样腺瘤移植于肾包膜下,存活28天。类骨质样骨瘤移植于裸鼠也成瘤并能传代生长。因而人的癌前病变和良性肿瘤也能够在裸鼠体内生长,为研究肿瘤的病因学提供了良好的实验动物模型。
    有些肿瘤组织靠组织活检切片很难下明确的诊断,还需要做一些特殊的检查如免疫组化检查,电镜、特殊组织化学染色等以协助诊断。我们可以通过肿瘤移植于裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型以辅助诊断。有人提出通过模型的实验治疗和肿瘤在裸鼠体内发展情况观察来指导临床实际病人的治疗和推测其预后。
    裸鼠移植癌保存原肿瘤的特性,这些特性中也包括了对抗癌药的感受性,这在一定程度上可以预测对人癌的化疗效果,并可以用于筛选新的有效抗癌药物。

(责任编辑:泉水)
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