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<<实验动物学>>(8)

时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 阅读:

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    综上所述,实验动物微生物控制无疑是保证实验动物质量和动物实验顺利进行的关键。
    二、实验动物微生物学和寄生虫学等级分类和控制标准
    (一)参照国际实验动物微生物质量控制和我国的实际情况,根据中华人民共和国技术监督局GB14922-94《实验动物微生物学和寄生虫学监测等级》规定,将实验动物按微生物控制程度,划分为四个等级。   
    一级  普通动物(conventional animal,CV) 不携带主要人兽共患病原和动物烈性传染病的病原。
    二级  清洁动物(clean animal,CL)除一级动物应排除的病原外,不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。
    三级  无特殊病原体动物(specific pathogen free animal,SPF)除一、二级动物应排除的病原外,不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。
    四级  无菌动物(germ free animal,GF)无可检出的一切生命体。
    (二) 细菌、真菌、病毒和寄生虫控制指标 
    1. 细菌、真菌指标应符合表3.1规定。2. 病毒指标应符合表3.2规定。
    3. 寄生虫指标应符合表3.3规定。
<原网页图表比较混乱,暂时省略。————longer>
第二节  实验动物的培育
一、无菌动物的人工培育
(一)无菌动物的饲育环境  无菌动物一般饲养在隔离器(Isolator)内,隔离器是一种对微生物绝对密闭的装置,其内部空间物体能承受高压蒸气或化学物灭菌,目前世界应用最广泛的是聚氯乙烯透明薄膜隔离器。隔器离内的用品、饲料、人工乳、手术器械等,都必须经过灭菌处理。
1. 灭菌措施  常用的灭菌方法是高压蒸气灭菌,过氧乙酸灭菌和放射线(γ-射线)灭菌方法。
2. 无菌实验  在饲养无菌动物过程中,必须对隔离器中的动物及排泄物、饲料、饮水等物品进行定期检测,确保无菌状态。
(二)无菌动物种群的建立
方法一:无菌剖腹产(子宫摘除术):是建立无菌动物种群最常用而可靠的方法。
1.主要装置:
          



  


手术隔离器(Operation Isolator)
2.手术隔离器用新配制的2%的过氧乙酸充分喷雾灭菌,保持24小时之后通气吹干。经微生物检测合格后使用。
3.选择待剖腹产的动物: 选择活泼、健康、发育良好、个体大的雌鼠。经微生物检测无垂直感染性疾病。雌鼠的品系、来源、繁殖方式和胎次,均应有准确的记录。通常选用第二、三胎孕鼠,其仔鼠发育较好,个体大,容易人工哺乳。
4.剖腹产术: 将雌鼠麻醉或脱颈椎处死后,立即置入2%过氧乙酸的烧杯中,浸泡10秒钟,取出后使其仰卧,用碘酒棉球擦拭腹部,从腹中线处切开,暴露子宫,将子宫连同胎儿一同摘出,随即放入2%的过氧乙酸烧杯中,用无菌纱布将子宫包好, 移入隔离器内,先用2%NaHCO3溶液中和子宫表面残留的过氧乙酸,然后切开子宫取出胎仔,用纱布擦去胎仔鼻和口部羊水,刺激胸部,促进呼吸。此操作应在30-35℃下进行,当胎仔变成鲜红色时即可去掉胎盘。此时可将胎仔移入另一隔离器喂养。
从处死雌鼠到胎仔的取出,动作要快,通常要求在5~6分钟内完成,否则,胎儿容易窒息死亡。
5. 哺乳 饲养在隔离器中的哺乳方法有两种 一是乳母代乳(Foster suckling),二是人工哺乳(Hand Rearing)。
①乳母代乳哺育法  将一个雌性动物的幼仔转给另一个雌性动物哺育称为代乳。当前已有不少单位饲养无菌大鼠和无菌小鼠等,引用已经培育的无菌动物,作为代乳母鼠,将代乳母鼠所生仔鼠留下2-3只,其他淘汰。以代乳母鼠的垫料撒在剖腹仔鼠的身上,将其放在代乳母鼠旁边,确定剖腹仔鼠已吃了代乳母鼠的奶以后,即可将该母鼠所生仔鼠全部淘汰。哺育3周后,剖腹仔鼠即可断乳。
代乳的母鼠应选择10-12周龄的雌鼠,与雄鼠交配时间应比剖腹雌鼠提前2~3 天。该代乳雌鼠在产前2-3天更换垫料。为防止污染,每个饲养隔离器最好只放一只代乳雌鼠和一窝同胎剖腹的仔鼠。
②人工哺乳  如果没有无菌动物作代乳母,人工哺乳是唯一的方法。由于新生仔鼠太小,人工哺乳较困难,最初七天每隔四小时哺乳一次,每日六次,八日龄后每日五次。小鼠每日授乳量因小鼠的品系、发育状况或饲喂次数,人工乳的组成成份等而稍有变化。一般日授乳量为体重的20%左右。体重为 2g的小鼠每日的总授乳量大约为0.54 ml,每次(一日六次)为0.09ml。
下面是两种人工乳汁的配方。
①家兔乳作大、小鼠人工乳(法国),人工或机械挤出家兔乳,经冷冻干燥,装入塑料袋中,用60Co照射灭菌,饲喂前用无菌水稀释到原浓度。
②山羊乳作小鼠人工乳(日本),山羊乳经低温灭菌,即60℃30分钟后,直接饲喂。
6.预产期的判断  哺乳动物的预产期,往往和临产期不一致,手术过早, 仔畜太小,不易成活,手术过晚,子宫颈口开放,胎膜破裂,产道病菌污染胎仔,最适时间应掌握在自然分娩前2~6小时。所以临产期的正确判断至关重要。概括起来有以下几点:
①触诊法  选择腹部膨满,外阴口潮红的孕畜,从后腹侧用拇指和食指触摸胎仔,当胎仔的头部和躯干大小一致,为临产期。此法适用于大、小鼠、豚鼠等。豚鼠常用耻骨联合检查法。当耻骨联合开启至能容纳拇指时(20~24mm)为临产期。
②推算法  以交配日期推算临产期的方法比较常用。此法适合于有明显交配标记和交配行为的动物。常见实验动物的妊娠期和哺乳期见表3.4 。
表3.4 常见实验动物的妊娠期和哺乳期
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动物名称   妊娠期(天)  哺乳期(天)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
小  鼠      19(18-21)     20(18-25)
大  鼠      20(19-22)     21(18-25)
豚  鼠      68(62-72)     20(18-25)
家  兔      30(29-35)     30(28-35)
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③观察法  动物临产前会出现很多生理现象和行为,如食欲下降、运动减少或不安、外阴部潮红肿大可见分泌物。
④人工延长产期  对于临产期的正确判断,即使经验丰富的人也难免有误。补救的办法是在上述临产期判断的基础上,给孕畜肌注黄体酮(人用量的5倍) 可延长产期一日左右。
剖腹产手术道理很简单,但做起来并不容易,经常有两个困难,其一是人工乳的配置, 其二是人工哺育方法,对于小鼠来讲,最大的困难是后者, 剖腹仔鼠不会从人工乳头吸引乳汁,所以经常要隔着隔离器的手套,用胃管给那么小的动物每隔3~4小时哺乳一次,1955年Plesants就开始培育无菌小鼠,到1958年终于培育出了无菌Swiss小鼠。因此, 目前世界上几乎所有的无菌小鼠Plesants建立的无菌小鼠的子孙。
方法二 实验动物的药物净化:
首先对用于净化的动物群进行全面的微生物学监测。一般选取健康的和携带寄生物(包括细菌、病毒和寄生虫)相对较少的动物作为种鼠,置于清洁环境中饲养,作为药物净化的对象。
清除体外寄生虫可用适当浓度的杀虫剂溶液(0.5~1%的敌百虫溶液)进行体表除虫,水温37℃,然后用0.1%的新洁而灭药浴,对动物进行体表消毒,把动物移入隔离器中。清除体内寄生虫、细菌可用几种驱虫药物和广谱抗菌素交替使用,如青霉素、链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等。动物经药物净化处理后,进行各项监测,以确定净化的效果。从中选取净化较好的动物作为种鼠繁殖。
二、悉生动物的培育及饲养
(一)基本概念
悉生动物(gnotobiotic animal)即己知菌动物或已知菌丛动物。是无菌动物培育成功之后相继出现的,悉生动物是指动物体内外所携带的其他生物(如病毒、细菌、寄生虫等)是已知的。从广义讲无菌动物也属于悉生动物。
(二)悉生动物的培育
悉生动物的饲养和管理与无菌动物相同,将动物饲养在隔离器内。不同的是悉生动物的隔离器内带有一定的已知菌。
已知菌动物,通常是在无菌动物的基础上经人工植入已知菌的动物。根据研究需要常给无菌动物植入单菌或多种菌。
当向无菌动物植入一种细菌时叫单菌动物(monogotoxenic), 二种细菌叫双菌动物(dignotoxenic),三种以上细菌叫多菌动物(polygnotoxenic)。不同国家对不同动物人工植入的细菌种类不同,如表3.5为不同国家或单位对豚鼠植入的细菌。
表3.5 不同国家悉生豚鼠植入的细菌
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菌  种        日本    法国    美国  中国医科院
──────────────────────────
大肠埃希氏杆菌          √√
表皮葡萄球菌     √
白色葡萄球菌             √
粪链球菌         √      √      √       √
乳酸杆菌         √             √√
脆弱拟杆菌       √              √      √√
双歧杆菌               
费新尼亚梭菌               
──────────────────────────
注:√√表示此菌植入了两个不同的株。
(三)无菌动物和悉生动物的生物学特征
1. 无菌动物
①生长发育体形较小

(责任编辑:泉水)
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