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<<实验动物学>>(9)

时间:2005-12-30 20:56来源:Internet 作者:bioguider 阅读:

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无菌大、小鼠一般生长发育比普通大、小鼠体形较小,而无菌动物寿命要比普通动物的寿命长。
有资料认为,不同种属无菌动物体重影响不易样,无菌鸟类比普通鸟体重大, 大小鼠基本相同,而无菌豚鼠、家兔比普通动物要小(由于缺乏肠道细菌, 不能分解利用纤维素)。
②盲肠肥大  无菌动物的盲肠比普通动物要大5~6倍,无菌豚鼠和家兔的盲肠可达体重的1/3。关于这一现象有两种解释,一是因微生物缺乏导致大分子酸性粘蛋白在盲肠内大量积聚,胶体渗透压增高,水分在盲肠内潴留;二是无菌动物体内水分潴积,大量进入盲肠的水分超出了大肠的回收能力,有较大量的水分经粪便排出,所以无菌动物通常排稀便,排尿量少。认为是主要是由于没有细菌,不能分解肠内有毒的物质。
③肠壁变薄、肝脏重量下降、心脏变小。肠道胆汁循环、白血球均有变化。
④免疫系统的改变  在缺乏微生物作用下细胞免疫和体液免疫器官发育迟缓,网状内皮系统、淋巴组织发育不良,脾脏小、无二级滤泡,淋巴小结内缺乏生发中心,故产生丙种球蛋白的能力很弱,血清中lgM、lgG水平低。
免疫功能处于原始状态,应答速度慢。过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。用低分子无抗原性饲料喂饲无菌动物时,血清中几乎不存在丙种球蛋白和特异性抗体。
⑤抗辐射能力强  普通动物受辐射后,往往是由于细菌感染引起并发症而造成动物死亡。无菌动物不存在这种情况,因而提高了抗辐射能力。
2. 悉生动物
悉生动物  可以弥补无菌动物的某些缺点,无菌动物抵抗力较弱,饲养管理困难,而悉生动物抵抗力明显增强,易饲养管理。在免疫学实验中,无菌动物不发生迟发性过敏反应,而感染一种大肠杆菌的悉生动物就可以发生迟发性过敏反应。
三、SPF动物的培育及饲养 
(一)SPF动物的培育 
建立SPF动物群,必须严格地选择原种。 
1.其原种可来源于无菌动物或悉生动物,将其饲养于SPF屏障系统中,使之自然感染特定病原体以外的一般微生物; 
2.亦可剖腹取胎后,在屏障设施中由SPF亲代动物抚育。 
(二)SPF动物的饲养设施 
SPF动物必须饲养在屏障系统内,并经严格的微生物控制,方可保证其质量标准。除全屏障系统隔离器外,SPF动物饲养于相对屏障系统中,常有以下 三种方式: 
1. 净化空气层流架, 
是一种较简便的气流屏障系统,适宜做动物实验。 
它的作用是通过空气净化和连续层流两方面的作用而实现的。空气经过初、中、高三级过滤,洁净度达到万级。 
层流架比隔离器容量要大,可在架子内进行肿瘤接种,注射、手术等多项实验工作。    层流架一般作为清洁系统的补充设施。 
2. SPF动物房,是饲养和生产SPF动物的大型设施。 
动物房内部的空气全部经过过滤除菌。 
利用空气的压力梯度来防止外界未经过滤除菌的空气进入。    饲料、饮水、垫料、笼具均灭菌后方可进入。 
工作人员进入SPF动物房时,需经过充分的淋浴,然后穿上灭菌工作服、鞋、帽、戴上口罩和手套。 
(三)SPF动物的饲养管理 
饲养在屏障系统中的SPF动物生产繁殖性能好,不易为外界有害微生物所污染。 
可得到较高的生产效益。 
一般每周只需更换一次垫料。 
及时添加饲料、饮水,保证食盒中不缺食,饮水瓶不断水。 
饲料现已作为商品供应的SPF动物灭菌料,也可自己配制,但应注意营养的全面,高压灭菌过程中易受破坏的维生素等成分的添加量要有保险系数,以保证动物生长获得较充足全面的营养。 
SPF动物饲养的关键在于要有严格的管理制度和操作规程,饲养人员和动物实验人员一定要熟练地掌握饲养设施的具体操作方法和技术,以保证生产和动物实验中SPF 动物不被污染。 
屏障系统的动物一但感染了病原微生物,它的传播往往比开放系统更加强烈,动物的损失将更大。 
四、清洁动物和普通动物的饲养 
(一)清洁动物也称最低限度疾病动物(Minimal disease animals)。 
原种群为屏障系统中的SPF动物或剖腹产动物,饲养在亚屏障系统,它比SPF动物要求排除的微生物和寄生虫少,并且在进行血清病毒抗体检查时,经常可检出一定滴度的抗体,但是在任何时候都不应具有明显可见的疾病症状、脏器的病理变化和异常的死亡。 
清洁动物所使用的饲料(要满足全价营养的需要)、垫料、用具等都要经过消毒灭菌处理,饮用水除高压灭菌外,也可采用PH2.0-2.5的酸化水,水质标准不能低于城市生活饮水标准,工作人员进入动物室需换无菌的工作服、鞋、帽、戴口罩进行操作。 
(二)普通动物的饲养 
饲养在开放的环境中,未经积极的微生物控制的实验动物叫普通动物。 
它要求不带有能够感染人的微生物和寄生虫,并排除动物群中可能发生的烈性传染病病原体,如动物的体外寄生虫、沙门氏菌、流行性出血热病毒、小鼠的鼠痘病毒等。 
为了预防人和动物共患病及动物群中烈性传染病的发生,普通动物在饲养管理中也必须采取一定的防护措施,如: 
饲料、垫料要消毒并防止野生啮齿动物的污染,饮水要符合城市卫生标准。 
不喂青饲料。 
外来动物必须严格隔离检疫。 
房屋要有防野生动物及防昆虫的设备。    要坚持经常性的环境卫生及笼具的清洗消毒。 
严格处理并及时淘汰死亡及患病动物。 
普通动物仅供教学实验和一般性实验用,不适合用于研究性实验。 
第三节  实验动物微生物和寄生虫监测 
一、实验动物细菌学监测 
(一)监测的意义和目的 
定期对各级实验动物群进行微生物学、寄生虫学监测, 以确定其是否符合原定级别,是保证实验动物质量的手段之一。通过监测可掌握动物群中传染性疾病的流行情况,及时诊断、发现并控制疾病的传播,保证动物健康。根据动物群中致病菌和条件致病菌的带菌状况,可将动物分成不同的级别。另外研究者可根据不同的实验目的选择不同级别的实验动物、确保实验结果的可靠性。 
(二)监测方法 
细菌监测是对实验动物致病菌携带状况的动态观察。其方法多采用病原学方法,即从动物体内分离培养病原菌。如鼠棒状杆菌的检验,在无菌条件下,取动物气管分泌物,回盲部内容物及病灶组织。将标本直接接种于血琼脂平皿,37℃培养48小时,鼠棒状杆菌在血琼脂平皿上呈白色,不透明、不溶血、触之较硬、不易乳化的菌落,48小时后菌落周围呈锯齿状。挑取可疑菌落纯培养进行革兰氏染色及生化鉴定。根据不同致病菌的特性,取样、培养及鉴定方法不尽相同。由于泰泽氏病原体由于不能在人工培养基上生长,通常采用醋酸可的松激发方法。当小鼠体内感染了泰泽氏病原体后,可出现松毛、弓背及内脏病变等,将动物处死、剖检。取病变组织直接压片、镜检并结合病理检查结果做出判断。 
目前国内、外亦有对实验动物部分致病菌检验采用了血清学方法,如使用凝集试验方法检查鼠伤寒沙门氏菌、鼠棒状杆菌及支气管败血性波氏杆菌等,但由于其特异性不如分离培养法,当抗体效价较低时仍以分离培养法的结果为准。 
(三)标本检验程序 
正常动物监测主要检查呼吸道和肠道,分别取气管分泌物或鼻咽腔分泌物及盲肠内容物作细菌培养检查。对于发病动物的病变组织和脏器作细菌学检查。根据送检动物的不同级别,对所需检查的病原菌进行逐项检查,并参照下列程序进行。 
1. 呼吸道标本的检验: 
呼吸道标本 
↓ 
           

流体培养基                血琼脂平皿 、麦康凯芢cell 

马丁半                矫蟆?HL平皿 
支                ?馨苎?圆ㄊ蟎par咸亚蚓?⒎窝譥               咸亚蚓?⒎窝譥 
↓ 
挑取可疑菌纯培养、镜检、生化、血清学诊断或动物实验等 
↓ 
报  告 
2. 肠道标本的检验: 
肠道标本 
↓ 
         
⒙罂悼? 

棒杆綷cell 
SS?                
                疑菌落纯培养、镜检、生化、血清学诊断或动物实验等 
                nbsp;
                无氧环境下生长,称谓厌氧菌;还有一些细菌在有氧、无氧环境下都可以生长,称谓兼性厌氧菌。 
    培养细菌目的,是从不纯的被检材料中找出特定的细菌或全部细菌,这一过程称为分离培养。如果只是培养性质明确的一种细菌,则称为纯培养。为了从被检材料中分离出所要检查的细菌,可以利用多种性质不同的选择性培养基,检查各种不同的目的细菌。 
    (1)培养基的种类  按物理性状可把培养基分为液体培养基、 半固体培养基和固体培养基三种。 
    (2)细菌的培养方法  根据培养细菌的目的不同,其方法也不尽相同,通常把细菌的培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。 
    ① 一般培养法  一般培养法又称需氧培养法,将已接种好的平皿、 斜面或液体培养基等,置37℃孵育箱内培养18-24小时,一般细菌即可于培养基上生长。 但也有少数生长缓慢的细菌需培养2~7天甚至更长时间才能生长。 
    ② 二氧化碳培养法  某些细菌如脑膜炎奈毖氏菌、布鲁氏菌及肺炎支原体等, 需要在一定的二氧化碳环境下才能良好生长,即二氧化碳培养法,常用方法有三种( 二氧化碳培养箱、烛缸法、重碳酸钠-盐酸法)。 
    ③ 厌氧培养法  目前常用的厌氧菌方法有厌氧灌法、气袋法(bio-bag) 及厌氧箱三种。 
    2. 细菌的鉴定和分类 
    把获得纯培养的细菌进行一系列生物学特性的检查,并确定其分类学上的位置,这个过程叫细菌鉴定。细菌生物学性状包括菌落形态、菌体形态、染色性质、生化反应以及血清学反应特性和特异性噬菌体等。 
    细菌的分类是根据其营养方式,各种生物学特性亲缘关系,将细菌划分为不同的门、纲、目、科、属、种。基本分类单位是种。       
    (1)菌落形态 
    菌落的特征是识别细菌的重要依据,观察菌落特征时应注意边缘是整齐的,还是锯齿的,表面是光滑的,还是粗糙的,中间是突起的,还是凹陷的,是透明的,还是半透明或不透明的。 ①如乙型溶血性链球菌,在血琼脂平皿上,菌落灰白色,圆形,中央稍凸起,透明或半透明,表面光滑,菌落周围可见透明的溶血环。②绿脓杆菌,在选择性培养基(NAC)上菌落扁平,边缘不整齐,大小不一,表面湿润,有光泽, 菌落周围有蓝绿色或褐色色素扩散,但也有不产生色素的菌珠。这些菌落特征在细菌的鉴定中均有一定意义。 
    (2)细菌的生化反应特性 
    各种细菌具有各自的独特酶系统,因而在代谢过程中所产生的分解与合成代谢产物也不同。这些代谢产物又各具不同的生化特点。根据此特点,利用生物化学方法来鉴别不同细菌,称为细菌的生化反应试验。生化反应试验方法很多,主要有以下几点: 
    ①糖(醇)类发酵试验  是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验,不同细菌可发酵不同的糖类,如沙门氏菌可发酵葡萄糖,但不能发酵乳糖,大肠杆菌则可发酵葡萄糖和乳糖;即使两种细菌均可发酵同一种糖类,其发酵结果也不尽相同,如志贺氏菌和大肠杆菌均可发酵葡萄糖,但前者仅产酸,而后者则产酸、产气,故可利用此试验鉴别细菌。 
    ②葡萄糖代谢类型鉴别试验  可用于葡萄球菌与微球菌的鉴别。 
    ③β-半乳糖苷酶试验(ONPG)迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性,如埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属等。而不发酵乳糖的细菌如沙门氏菌、变形杆菌和肠杆菌科中其他不发酵乳糖的细菌均为阴性。 
    ④淀粉水解试验、七叶苷水解试验、甲基红试验、及VP试验等。 
    (3)革兰氏染色法 
    染色除能观察细菌形态外,还可根据其染色反应,将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类。如沙门氏菌属、志贺氏菌属、巴氏杆菌、及耶尔森氏菌等均为革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌有肺炎链球菌,单核细胞增多性李氏杆菌,金黄色葡萄球菌,鼠棒状杆菌等。 
    (4)血清学鉴定   
    除生化鉴定外,必要时可进行血清学鉴定。如沙门氏菌属,志贺氏菌属,绿脓杆菌,耶尔森氏菌等均可作血清学分型试验。 
   (五)分子微生物学在细菌分类鉴定中的应用 
    1. 测定DNA G+C mol%含量 
    组成细菌染色体DNA的碱基共有四种(G、C、A、T),如果把这四种碱基的总分子含量看作100,那么细菌DNA的碱基成分可用鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)对全部四个碱基的摩尔百分比(mol%)来表示(G+Cmol%)。每一个生物种的染色体DNA中G+C mol%的含量都是特定的,在动植物中G+C的含量变动幅度较窄,大约在35%~40%。原生动物的G+C含量变幅较宽,而原核生物的G+C含量变动幅度最宽,可达25%~80%,如革兰阴性线形螺菌 ( pirillum linum)为28%~30%,某些种的诺卡氏菌(nocardia)为70%~80%。同时研究证明,同一种细菌的G+C mol%含量变化范围很小,且比较稳定,它不受菌龄的影响,也不受除去突变因素之外的生长条件等外界因素的影响,所以G+C mol%的测定已成为细菌分类学上一个有价值的指标。 
    (1)G+C mol%含量测定是细菌分类鉴定的一个重要指标。G+C mol%含量不同的细菌,可以肯定不是同种细菌;G+C mol%含量相同的细菌很可能是相近或相同的种属,但也可能是不同的细菌,为确切地做出决定,尚应通过核酸杂交进一步确定。 
    (2)若两株细菌的G+C mol%含量的差别在10%-15%,可认为不是同属,甚至是不同科的细菌,若差别在4%-5%之间,可认为是同种内的不同菌株;若差别在2%以内,无任何意义。 
    (3)G+C mol%测定是新菌种鉴定的主要依据,在常规的细菌学检验中,细菌的形态学、生理学和生物化学特点对细菌的鉴定有着重要的意义。但是若确定所分离出的细菌是否是新科、新属、新种,可测定G+C mol%,把分子生物学指标与表型特征结合起来进行分析。 
    2. 细菌核酸杂交技术在细菌分类鉴定中的应用 
    核酸分子杂交技术的原理是根据分子量较大的无放射性单链DNA,与分子量较小的放射性标记的单链DNA(或RNA),按互补碱基顺序配对的特点,在一定的条件下,使它们的互补碱基之间形成氢键,从而把两条单链连接起来成为一种DNA-DNA(或DNA-RNA)的双链杂交分子。将未配对的标记DNA片段洗脱,然后进行放射性测定,求得两种DNA链杂交的百分比。 

(责任编辑:泉水)
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