背景介绍：人类外周血单核细胞（PBMCs）在免疫学、细胞治疗和疾病研究中具有重要应用。通过血液分离技术，可以获得纯净的单核细胞群体，包括淋巴细胞和单核细胞，便于后续的免疫分析和细胞培养。
操作流程：
- 将血库获得的血液样本中的Buffy Coat（白细胞层）倒入一个125毫升的锥形离心管中，并用无菌无内毒素的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至90毫升。
- 加入15毫升无菌的葡聚糖/PBS混合液，颠倒混匀四到五次。如出现气泡，用1毫升塑料吸管去除气泡。
- 在室温下静置20分钟，使红细胞沉降。
- 用塑料吸管将上清液转移到新管中，加入等体积的含EDTA的PBS，防止血小板聚集。
- 在室温下以1000×g离心10分钟，沉淀白细胞，血小板留在悬浮液中。
- 将上清液倒入含漂白剂的容器中，重悬细胞沉淀于1-2毫升PBS中，转移到新管中，避免血小板粘附在管壁上污染样品。
- 将细胞悬液稀释至50毫升，缓慢将12.5毫升悬液覆盖在含Ficoll-Hypaque的离心管中（每管15毫升Ficoll-Hypaque），形成密度梯度。
- 以800×g离心20分钟（无刹车），在12°C条件下进行。
- 单核细胞会在PBS/Ficoll界面形成浑浊的环，用2或5毫升吸管轻轻采集该界面层的细胞。
- 将采集的细胞转移到新管中，用PBS补足，离心沉淀细胞（800×g，至少10分钟），弃去上清液，重悬于适宜的缓冲液中。
缓冲液配制：
- PBS/EDTA：含有4.3 mM Na₂HPO₄、2.7 mM KCl、1.8 mM KH₂PO₄、5 mM EDTA和137 mM NaCl，pH 7.2。
- PBS：含有4.3 mM Na₂HPO₄、2.7 mM KCl、1.8 mM KH₂PO₄和137 mM NaCl，pH 7.2。
- Ficoll-Hypaque 1077：在室温下预热15毫升，确保平衡。
- Dextran/PBS：6%（w/v）Dextran T500，使用无钙钙镁离子的PBS制备。
注意事项：
- 操作过程中应严格遵守生物安全规范，避免血液样本的污染和交叉感染。
（提示：此物质具有生物危害性，应参照MSDS和机构政策进行处理。） - 气泡会捕获红细胞，影响分离效果，操作时应注意去除气泡。
- 若需去除单核细胞中的单核细胞，可以将细胞在10厘米培养皿中培养30分钟至1小时，单核细胞会粘附在塑料表面，未粘附的淋巴细胞可转移至新管中用于后续实验。